猪CIDE家族基因的克隆及功能研究

论文摘要

梅山猪是我国优秀地方猪种,是国内外猪遗传育种的重要品种资源,其重要功能基因的克隆、分析鉴定和生物学特性研究有助于积累和开发利用我国重要地方猪种的基因资源信息,为优良猪种的遗传改良提供理论依据。在真核生物中,细胞凋亡是一种进化上保守的现象,它在调节正常细胞的活性方面发挥着十分重要的作用。在细胞凋亡过程中,DNA的片段化是一个关键的步骤,它是由DNA片段化因子（DFF）所诱导的。DFF含有两个亚基,一个是核酸酶（DFF40）,另一个是它的抑制物（DFF45）。最近发现了一个新的诱导细胞死亡的类似DFF45的蛋白家族（cell death-inducing DFF45-like effectors,CIDEs）,CIDE蛋白的过度表达可以导致细胞凋亡的发生。在CIDE蛋白家族中,已报道有三个成员来源于人（hCIDEa、hCIDEb和hCIDEc）,三个成员来源于小鼠(mCIDEa,mCIDEb和脂肪特异性蛋白27（Fat-specific protein of 27 kDa,FSP27;是人CIDEc在小鼠中的同源蛋白）,但在猪上还未见有报道。CIDE蛋白家族除了具有前凋亡蛋白的功能外,在脂代谢和脂肪细胞分化调控过程中也有很重要的作用,所以将其作为人类肥胖的候选基因之一。本文以猪为研究对象,首次对猪CIDE家族的3个基因及CIDEb的剪接体进行了基因克隆,通过基因组PCR获取基因组序列并对其进行基因结构分析,利用辐射杂种细胞板技术和半定量RT-PCR等方法进行了基因的染色体定位和组织表达分析;同时研究了它们在遗传脂肪型猪（通城猪）和瘦肉型猪（大白猪）组织中的表达差异;另外还通过分子克隆技术构建基因编码区及启动子区域的真核或原核细胞表达载体,以猪肾细胞系IB细胞为研究对象,通过细胞培养和基因转染,实现目的基因的离体细胞超表达,从而对其表达调控进行初步研究。研究结果如下:1、扩增得到梅山猪CIDE家族3个成员的包含全长编码区及部分非编码区的cDNA序列,并对其进行了生物信息学的分析。其中CIDEa和CIDEb编码区均为660bp,编码219个氨基酸;CIDEc编码区为717bp,编码238个氨基酸。在蛋白质水平上,CIDEa与人、小鼠CIDEa分别享有80.5%,75.8%的相似性;CIDEb与人、小鼠CIDEb分别享有85.8%,80.0%的相似性;CIDEc与人、小鼠CIDEc分别享有82.8%,73.2%的相似性。证明CIDE蛋白具有较强的保守性,预示着其重要的生理作用。2、扩增获得CIDEb的基因组序列、CIDEa和CIDEc的内含子序列,并利用生物信息学方法得到猪CIDEc的全长基因组序列。根据所得到的基因组及内含子序列设计引物,用辐射杂种板技术将CIDEa、CIDEb和CIDEc分别定位在6q21-26、7q21和13q31。并且这3个基因的定位结果与人基因组中相应基因的染色体位置相对应。3、以梅山猪的脂肪组织、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、肠、脑、肾、淋巴等十一个组织样品为材料,用半定量RT-PCR的方法研究了CIDE家族在mRNA水平上的组织表达谱。结果表明CIDEa、CIDEb和CIDEc均在脂肪组织中高量表达、在淋巴组织中大量表达。另外,CIDEa在脾、肺、肾、肝、脑和胃中较多量表达,在小肠、肌肉和心脏中微量表达;CIDEb在肝、小肠、脑中大量表达,在脾、肺、肾中较多量表达,在胃、肌、心中微量表达;而CIDEc在小肠、脑中大量表达,在肺、肾和肝中较多量表达,在其他组织中微量表达。4、以遗传脂肪型猪（通城猪）和遗传瘦肉型猪（大白猪）的组织样品为材料,对mRNA水平上CIDE家族在两种不同类型猪中的组织表达差异进行了研究。结果显示CIDEa和CIDEc基因在通城猪脂肪和肝脏中的表达量高于大白猪的相应组织,而CIDEb基因在通城猪脂肪中的表达量却低于大白猪的相应组织。5、实验结果证实在猪中存在CIDEb的一个差异剪接体CIDEb2,得到包含432bp全长编码区的的652bp的cDNA序列,编码143个氨基酸,它是由野生型CIDEb发生191bp的缺失所产生。通过半定量RT-PCR检测发现CIDEb2除了在胃中没有检测到外,在其他组织中都有表达,但是表达量比CIDEb少得多。通过对人和鼠的EST、mRNA数据库进行检索分析,没有检测到CIDEb的这种特异性的剪接体CIDEb2,说明这种剪接方式可能只存在于猪中。6、对猪CIDEb的基因组序列进行了CpG岛和核心启动子区域的生物信息学分析,并在预测的启动子区域进行转录因子结合位点分析,发现具有PPAR/RXR、NF-κB、CREB、SREBP、HNF-4α、KLF15和HMGA family等转录因子的识别位点。并将猪CIDEb核心启动子序列构建成不同长短的启动子双荧光素酶报告载体及绿色荧光载体,转染细胞以检测验证核心启动子的区域及启动子强弱。7、通过脂质体转染法能够有效地在猪肾细胞系IB细胞中超表达CIDEb。应用分子克隆技术成功构建了猪CIDEb的全长真核表达载体（CIDEb-pIRES-EGFP全长非融合绿色荧光真核表达载体、CIDEb-PeDNA3.1（-）超表达载体）,并在猪肾IB细胞中进行了超表达的初步研究。构建了猪CIDEb的全长原核表达载体（CIDEb-PGEX-4T-1）,并送天津赛尔生物有限公司制备了兔抗猪CIDEb多克隆抗体,为后续的功能研究准备了基础条件。

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摘要

ABSTRACT

缩略语表

1 前言

1.1 脂肪细胞分化及其分子调节

1.1.1 转录因子

1.1.2 脂肪形成的诱导因素

1.1.3 脂肪形成的抑制因素

1.2 脂类代谢

1.2.1 脂肪酸合成

1.2.2 脂肪酸氧化

1.3 CIDE家族的研究进展

1.3.1 CIDE家族的发现

1.3.2 CIDE家族的结构和功能特征

1.3.2.1 CIDEa

1.3.2.2 CIDEb

1.3.2.3 CIDEc/FSP27

1.3.3 CIDE家族的组织特异性分布

1.3.4 CIDE家族的亚细胞定位

1.3.5 CIDE家族与脂肪代谢

1.3.6 CIDE家族与细胞凋亡

1.4 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物及RNA样品

2.1.2 DNA样品

2.1.2.1 cDNA

2.1.2.2 用于基因片段分离的基因组DNA

2.1.2.3 用于基因染色体定位的DNA

2.1.3 工具酶及主要生化试剂

2.1.4 试剂盒

2.1.5 质粒和菌株

2.1.6 细胞

2.1.7 主要仪器

2.1.8 常用试剂配制

2.1.9 分子生物学软件

2.2 实验方法

2.2.1 总RNA的提取、纯化处理及鉴定

2.2.1.1 组织总RNA的提取（参照Trizol（上海生工）说明书）

2.2.1.2 细胞总RNA的提取（参照Invitrogon Trizol说明书）

2.2.1.3 组织总RNA的纯化（参照DNase Ⅰ说明书）

2.2.1.4 总RNA质量、纯度及含量检测

2.2.2 CIDE家族基因的克隆

2.2.2.1 CIDE家族基因cDNA制备

2.2.2.2 PCR扩增产物的纯化

2.2.2.3 扩增产物的鉴定（克隆和测序）

2.2.2.4 DNA序列同源性比较与鉴定

2.2.3 CIDE家族基因的染色体定位

2.2.3.1 总DNA提取

2.2.3.2 CIDEa、CIDEc基因内含子序列的扩增

2.2.3.3 CIDEb基因组序列的扩增

2.2.3.4 CIDEc全基因组序列的电子扩增

2.2.3.5 染色体定位所用引物的设计及特异性检测

2.2.3.6 各基因染色体定位所扩增片断大小及PCR反应条件

2.2.3.7 PCR扩增条带分型

2.2.3.8 染色体定位及数据分析

2.2.4 半定量PCR检测猪CIDE家族基因的组织表达谱

2.2.4.1 组织表达谱的引物设计

2.2.4.2 CIDE家族基因和GAPDH扩增的指数期循环数的确定

2.2.4.3 CIDE家族基因和GAPDH扩增的PCR反应条件

2.2.4.4 半定量分析

2.2.5 细胞实验

2.2.5.1 CIDEb真核表达载体的构建

2.2.5.2 质粒的大量制备

2.2.5.3 质粒浓度和纯度检测

2.2.5.4 细胞培养条件

2.2.5.5 细胞瞬时转染

2.2.5.6 CIDEb启动子的载体构建

3 结果与分析

3.1 总RNA质量和含量测定

3.2 猪CIDE家族基因全长cDNA的克隆与序列分析

3.2.1 猪CIDEa、CIDEb、CIDEc基因全编码区cDNA的克隆与序列分析

3.2.2 猪CIDEb基因差异剪接体全编码区cDNA的克隆与序列分析

3.2.2.1 猪CIDEb及其差异剪接体的部分cDNA的特异扩增

3.2.2.2 CIDEb差异剪接体在其他物种中的检测

3.2.2.3 猪CIDEb及其差异剪接体的组织表达谱

3.3 猪CIDE家族基因组序列及染色体定位

3.3.1 猪CIDE家族基因组片断的扩增

3.3.2 猪CIDE家族基因组序列分析

3.3.3 猪CIDE家族基因的染色体定位

3.3.4 猪CIDEb基因组启动子区的克隆及结构分析

3.4 猪CIDE家族基因各成员的组织表达谱

3.4.1 CIDE家族基因各成员在梅山猪不同组织中的表达差异

3.4.2 CIDE家族基因在脂肪和肝脏中表达的遗传差异

3.5 猪CIDEb真核表达载体的构建及表达

4 讨论

4.1 猪CIDE家族基因的结构分析

4.2 猪CIDE家族基因的染色体位置

4.2.1 辐射杂种板细胞系技术作为基因定位方法的优缺点

4.2.2 猪CIDE家族基因在染色体上定位结果及其定位区域QTL分布

4.3 猪CIDE家族基因表达的组织及品种差异

4.3.1 CIDE家族基因的表达分布与脂肪沉积的关系

5 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

研究生在读期间论文发表情况

致谢

附录1

附录2

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