论文摘要
目的:（1）比较日本血吸虫DNA重复序列pSjrh1.0（U92488.1）、18S小亚基单位核糖体核酸基因（18SrRNA）序列（AY157226.1）和SjR2的G55A克隆（AF412221.1）在基因组中的丰度,初步确定SYBR Green I荧光实时定量PCR（RQ-PCR）方法检测日本血吸虫的较适宜靶基因和反应条件。（2）建立SYBR Green I荧光RQ-PCR检测水体中日本血吸虫DNA的方法,作DNA浓度对数和初始循环数（Ct值）的标准曲线,评价方法的可靠性。（3）定量检测水体中日本血吸虫尾蚴,作尾蚴数的对数和Ct值的标准曲线,评估水体中日本血吸虫尾蚴的数量。（4）比较RQ-PCR法与ELISA法的早期检测日本血吸虫尾蚴感染的效果,选择较好的早期诊断方法。方法:（1）设计常规PCR引物,建立温度梯度PCR,并对扩增产物进行测序,确定保守序列。（2）根据测序结果,针对三个重复序列的保守序列设计RQ-PCR引物,通过建立温度梯度和浓度梯度RQ-PCR,确定丰度较高的靶序列。（3）在较适宜的反应条件下,作日本血吸虫DNA浓度对数和Ct值的标准曲线,得到相关系数。（4）绘制日本血吸虫尾蚴数量和Ct值的标准曲线,得到相关系数。（5）分别用ROSE法和全基因组提取试剂盒提取5、10和20条尾蚴感染第2、4、6、8和15天的小鼠血清中DNA,用RQ-PCR进行检测;用ELISA法检测第1、2、3和4w感染尾蚴的小鼠血清中抗日本血吸虫虫体抗原的IgG,确定可检测到小鼠感染日本血吸虫尾蚴的最早时间。结果:（1）普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电脉,表明:pSjrh1.0和18SrRNA在退火温度57.4℃下,引物浓度为20pmol时,反应体系较佳;G55A在退火温度58.8℃下,引物浓度为20pmol时,反应体系较佳。对其测序结果表明:pSjrh1.0的产物与NCBI发表序列比较,只有一个碱基不同;18SrRNA的产物与NCBI发表序列比较,完全相同;而G55A的变异性较大,与NCBI发表序列比较,有20多个碱基不同。（2）设计荧光RQ-PCR引物,扩增片段约为160bp,温度梯度PCRjrh1.0在基因组中的丰度最高。（3）以pSjrh1.0为靶序列建立RQ-PCR可检测到本血吸虫成虫基因组DNA的浓度为2fg,用配套软件绘制2fg2×108fg的标准曲,相关系数为0.9977,而对DNA为0.2fg的浓度下和阴性对照双蒸水的检测结为阴性。重复实验表明,其变异系数小于2%,可靠性很好。（4）分别提取1、5、、20和80条日本血吸虫尾蚴的DNA,建立尾蚴条数的对数和Ct值的标准曲线,相关系数为0.9186,相关性良好。重复实验和标准曲线的变异系数都小于3%,靠性良好。（5）对ROSE法和试剂盒法提取感染小鼠血清中DNA的检测结果表:ROSE法较试剂盒法的检测阳性率更高。感染10条尾蚴的小鼠第2w的检测果为阳性,而用ELISA法检测第4w仍为阴性。结论:RQ-PCR较普通PCR方法具有更高的检测精度,特异性高,可靠性好; pSjrh1.0为靶基因建立的荧光PCR方法可检测到2fg的日本血吸虫DNA,DNA度的对数和Ct值具有良好的线性关系,尾蚴数的对数和Ct值具有良好的线性关,且可靠性良好,Ct值能够准确反应尾蚴的数量。本方法建立的RQ-PCR具有好的早期诊断效果和临床应用价值。