新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究

论文摘要

病毒样颗粒（Virus-like particles,VLP）是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,不含有病毒核酸,不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,俗称为伪病毒颗粒或假病毒颗粒。近年来,VLP技术在病毒的形态学研究、病毒的组装和出芽机制的研究以及某些传染病的疫苗开发上应用广泛。例如,在人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）、人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）和轮状病毒（Rotavirus）等诸多病毒的形态发生学、病毒装配、病毒的出芽机制以及高效疫苗开发等研究上均取得了可喜的进展,VLP技术发挥了越来越重要的作用。 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是引起禽类急性、高度接触性传染病—新城疫（Newcastle disease,ND）的病原,给养禽业造成了严重经济损失,虽然有疫苗可用于该病的预防,但由于对病原的致病机理、免疫机理了解不充分,一直没能从根本上控制该病。迄今为止,对NDV的研究局限于针对单个基因的结构与功能方面,对各基因的功能及其编码蛋白之间的相互作用还不是很清楚。本研究针对NDV出芽机制不清楚和亚单位疫苗免疫效果不理想这一重要理论和实践问题,拟以VLP技术为突破口,阐明NDV出芽的主要机制和影响因素。 由于哺乳动物细胞的转录、转译和转译后修饰的保守性,在真核细胞中表达的重组蛋白可具备功能性,可进行结构与功能的分析以及蛋白质对细胞功能生理效应的分析。杆状病毒表达系统可为高水平表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境,能进行翻译后的加工修饰,此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达。所以,本试验首次在哺乳动物细胞和昆虫细胞-杆状病毒表达系统建立NDV-LP的技术,并进一步研究VLP的形成和病毒的出芽机制,以及病毒与细胞之间相互作用的机理,并为研发新型的亚单位疫苗奠定基础。 在哺乳动物细胞表达系统中,分别构建了瞬时表达F48E9株NDV结构蛋白M、NP、F和HN的重组表达质粒pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN,采用脂质体转染HeLa细胞后。通过间接免疫荧光试验证明四个结构蛋白均能够瞬时表达成功。pCAGG-M、pCAGG-NP单独转染HeLa细胞后,进一步通过western blot试验检测到了M和NP蛋白的表达:同时pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞时,观察到明显的细胞融合现象。NDV的F蛋白为融合蛋白,具有细胞融合活性,但仅F蛋白的单独作用还不能诱导细胞融合,其功能的发挥还需要HN蛋白的协同作用。这一结果也佐证了所构建的重组表达质粒pCAGG-F和pCAGG-HN转染HeLa细胞后,F和HN蛋白得到了成功表达,并且具有功能活性。在证明重组质粒单独表达成功后,pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN共转染HeLa细胞,通过western blot在细胞培养上清中,检测到了四个结构蛋白的共表达。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1 VLP在基础研究中的应用
• 1.1 VLP在病毒形态发生学方面的研究
• 1.2 VLP在病毒组装和复制过程中的研究
• 1.3 VLP在囊膜病毒出芽过程中的研究
• 2 病毒样颗粒在预防医学和疫苗开发中的应用
• 2.1 VLP在HIV的研究与应用
• 2.2 VLP在HPV的研究与应用
• 2.3 VLP在HCV的研究与应用
• 2.4 VLP在HEV的研究与应用
• 2.5 在其他病毒性疫苗研制中的作用
• 3 耦联VLP疫苗
• 4 VLP在分子载体中的研究应用
• 5 VLP在免疫测定中的应用
• 5.1 在抗原检测中的应用
• 5.2 在抗体检测中的应用
• 6 存在的问题与展望
• 7 本研究的目的与意义
• 第二章 新城疫病毒样颗粒在哺乳动物细胞内的出芽
• 2.1 材料与方法
• 2.2.1 质粒与菌株
• 2.2.2 酶与标记物
• 2.2.3 细胞培养用试剂
• 2.2.4 仪器设备
• 2.2.5 引物
• 2.2.6 DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.7 M、NP、F和HN基因的克隆
• 2.2.8 重组表达载体的构建
• 2.2.9 重组质粒的纯化
• 2.2.10 间接免疫荧光试验
• 2.2.11 重组质粒共转染HeLa细胞
• 2.2.12 重组质粒共转染Vero细胞
• 2.2.13 抗NDV M和NP蛋白阳性血清的制备
• 2.2.14 Western blot检测M、NP蛋白的表达
• 2.2.15 Western blot检测M、NP、F和HN蛋白的共表达
• 2.2.16 透射电镜样品的制备
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组质粒的构建
• 2.2.2 间接免疫荧光试验
• 2.2.3 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染HeLa细胞
• 2.2.4 pCAGG-M与pCAGG-NP、pCAGG-F、pCAGG-HN组合共转染Vero细胞
• 2.2.5 原核表达NDV的M蛋白和NP蛋白
• 2.2.6 western blot检测M和NP蛋白在HeLa细胞上的表达
• 2.2.7 western blot检测M、NP、F和HN蛋白在HeLa细胞上的共表达
• 2.2.8 透射电镜结果
• 2.3 讨论
• 第三章 新城疫病毒样颗粒在昆虫细胞内的出芽
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 质粒与菌株
• 3.1.2 酶与标记物
• 3.1.3 扩增引物
• 3.1.4 突变引物
• 3.1.5 F和NP基因的点突变过程
• 3.1.6 M和HN基因的扩增
• 3.1.7 M、NP、F和HN全长基因的亚克隆
• 3.1.8 pAcAB4-F、pAcAB4-F-NP-M和pAcAB4-F-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建
• 3.1.9 pAcAB4-NP、pAcAB4-NP-M和pAcAB4-NP-M-HN杆状病毒转移载体的构建
• 3.1.10 pAcAB4-M和pAcAB4-HN杆状病毒转移载体的构建
• 3.1.11 转染用质粒的纯化
• 3.1.12 Sf9昆虫细胞的复苏
• 3.1.13 转染昆虫细胞
• 3.1.14 重组杆状病毒的PCR鉴定
• 3.1.15 蚀斑纯化重组杆状病毒
• 3.1.16 间接免疫荧光试验
• 3.1.17 M，NP，F和HN蛋白的共表达
• 3.1.18 M，NP，F和HN蛋白的单独表达
• 3.1.19 细胞超薄切片样品制作和观察
• 3.1.20 透射电镜观察VLP结构
• 3.2 结果
• 3.2.1 F和NP基因的点突变
• 3.2.2 M和HN基因的克隆
• 3.2.3 杆状病毒转移载体的构建过程
• 3.2.4 蚀斑纯化重组杆状病毒的PCR鉴定
• 3.2.5 间接免疫荧光试验结果
• 3.2.6 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的共表达
• 3.2.7 M，NP，F和HN蛋白在昆虫细胞内的单独表达
• 3.2.8 细胞超薄切片
• 3.2.9 负染电镜结果
• 3.3 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 简历