苏云金芽胞杆菌株CT-43质粒的生物信息学分析

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株CT-43是本室分离的高效、广谱商品“双毒制剂”的生产菌株,除产多种杀虫晶体蛋白外,还高产苏云金素,除对鳞翅目害虫高毒外,还对双翅目害虫家蝇、韭菜蛆以及翘翅目害虫桑天牛等有高防效。通过对其进行全基因组测序,发现共有10个大小不同的质粒,是已报道测序的苏云金芽胞杆菌中质粒数较多的,本研究从质粒进化、复制蛋白、毒素蛋白、调控蛋白和可移动遗传因子等方面对10个质粒进行了系统的生物信息学分析,为菌株杀虫活性的提高、杀虫机制和昆虫抗药性的研究以及质粒的基础研究提供良好的理论依据。最大的质粒pBMB281编码4个杀虫晶体蛋白（Cry1Aa3、Cry1Ia14、Cry2Aa9和Cry2Ab1）,1个营养期杀虫蛋白（Vip3Aa10）和1个溶血性肠毒素。其与质粒pBtoxic具有高度同源的复制相关蛋白,推测pBMB281的复制机制可能是在含有杀虫晶体蛋白的大质粒中所特有的。pBMB281共有57个基因编码可移动遗传因子,占整个基因数的19.86%,包括15个完整的插入序列单元,2个转座子（Tn554和Tn1546）,7个Ⅱ型内含子和5个整合重组酶,如此多的可移动遗传因子说明该质粒具有很高的遗传可塑性。pBMB281还编码19个调控相关蛋白,包括3个能够调节芽胞形成和胞外蛋白酶表达的Rap-Phr调控系统。pBMB281编码一个完整的CRISPR/Cas系统,含有2个CRISPR座位,推测该系统对菌株CT-43具有抵御外源遗传物质入侵,保护细胞基因组完整性的功能。质粒pBMB281与苏云金芽胞杆菌YBT-1520的大质粒pBMB293具有近乎一致的高度同源性,由于它们同样含有多个可移动遗传因子及结合转移相关基因,且大部分差异存在于可移动遗传因子位点处,推测菌株CT-43和YBT-1520这两个在表型和血清型上不相同的菌株,很可能在进化中发生了质粒的结合转移。质粒pCT127编码1个杀虫晶体蛋白（Cry1Bal）。pCT127还与菌株CT-43苏云金素的产生密切相关,含有同属一个操纵子的5个连续基因组成的一个潜在苏云金素合成基因簇,该基因簇旁边紧邻一个类Ⅳ型分泌系统。pCT127中有17个基因编码可移动遗传因子,包括5个完整的插入序列单元,2个转座子（Tn554和Tn1546）,2个Ⅱ型内含子和1个整合重组酶。pCT127所编码的S-层蛋白对菌株CT-43的表型可能有着重要的影响。质粒pCT83的100个ORFs中有近11%的ORFs编码转录调控蛋白,说明该质粒的存在,对菌株具有重要的调控作用。质粒pCT72与苏云金芽胞杆菌YBT-1520的质粒pBMB67具有相当高的基因组序列同源性,pCT72的86个ORFs中有79个与pBMB67的基因高度同源,占所有编码基因的91.86%,两质粒的主要差异与可移动遗传因子有关。质粒pCT51中功能相似的ORFs成模块化分布,分为了3个区域：复制调控区,可移动遗传因子区,功能区。质粒pCT14、pCT8513和pCT8252都属于滚环复制类群Ⅲ质粒家族,为该质粒家族的新成员。质粒pCT9547属于滚环复制类群Ⅶ质粒家族,通过与质粒pTXI4-2和pGI2进行多序列比对,找到了位于质粒第8674到第8697位点的结合转移起始位点oriT。规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly itnerspaced short palindromicrepeats,CRIPSR）是最近发现针对噬菌体等外源遗传物质的获得性和可遗传性的新型原核生物防御系统。通过BLAST、多序列比对、RNA二级结构预测等生物信息学方法以及RT一PCR对己经完成全基因组测序的蜡状芽胞杆菌群42个菌株进行C租SPR的系统分析,结果表明,24%的菌株含有该结构;8个CRISPR座位的止向重复序列可以形成RNA二级结构,提示正向重复序列可能介导外源DNA或RNA与CAS编码蛋白的相互作用;31%的间区序列与噬菌体、质粒、蜡状芽胞杆菌群基因组序列具有同源性,进一步验证间区序列很可能来源于外源可移动遗传因子。苏云金芽胞杆菌CT-43中cas5和csdl基因在无外界环境刺激的情况下可以转录,推测CIRSP/Cas系统很可能在无任何外界遗传物质入侵的情况下也可以发挥防御功能。由于大部分蜡状芽胞杆菌群菌株含有多个前噬菌体和质粒,通过对蜡状芽胞杆菌群CRISPR的分析,为揭示其对宿主菌与噬菌体,以及宿主菌与质粒间的关系奠定基础。

论文目录

• 第一部分 苏云金芽胞杆菌菌株CT-43质粒的生物信息学分析
• 1.1 摘要
• 1.2 Abstract
• 缩略语
• 1.3 前言
• 1.3.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.3.2 苏云金芽胞杆菌基因组研究概况
• 1.3.2.1 苏云金芽胞杆菌基因组测序概况
• 1.3.2.2 苏云金芽胞杆菌基因组结构及特征
• 1.3.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒结构及特征
• 1.3.2.4 苏云金芽胞杆菌比较基因组学研究
• 1.3.3 研究目的和意义
• 1.4 材料与方法
• 1.4.1 实验数据
• 1.4.2 基因预测与功能注释
• 1.4.3 基因序列分析
• 1.4.4 质粒CRISPR结构分析
• 1.5 结果与讨论
• 1.5.1 质粒pCT281
• 1.5.1.1 基本特征
• 1.5.1.2 复制与分裂
• 1.5.1.3 与杀虫有关的毒力因子
• 1.5.1.4 可移动遗传因子
• 1.5.1.5 调控蛋白
• 1.5.1.6 规律成簇间隔短回文重复
• 1.5.1.7 质粒pCT281的比较基因组学和进化分析
• 1.5.2 质粒pCT127
• 1.5.2.1 基本特征
• 1.5.2.2 进化分析
• 1.5.2.3 复制
• 1.5.2.4 杀虫晶体蛋白
• 1.5.2.5 苏云金素
• 1.5.2.6 可移动遗传因子
• 1.5.2.7 调控蛋白
• 1.5.2.8 其它可能影响表型的编码基因
• 1.5.3 质粒pCT83
• 1.5.3.1 基本特征
• 1.5.3.2 复制
• 1.5.3.3 调控蛋白
• 1.5.3.4 可移动遗传因子
• 1.5.3.5 其它可能影响表型的编码基因
• 1.5.4 质粒pCT72
• 1.5.4.1 基本特征
• 1.5.4.2 进化分析
• 1.5.4.3 复制与调控
• 1.5.4.4 结合转移相关基因
• 1.5.4.5 可移动遗传因子
• 1.5.5 质粒pCT51
• 1.5.5.1 基本特征
• 1.5.5.2 复制调控区
• 1.5.5.3 可移动遗传因子区
• 1.5.5.4 功能区
• 1.5.6 质粒pCT14
• 1.5.6.1 基本特征
• 1.5.6.2 结果与分析
• 1.5.7 质粒pCT9547
• 1.5.7.1 基本特征与分析结果
• 1.5.8 质粒pCT8513
• 1.5.8.1 基本特征
• 1.5.7.2 结果与分析
• 1.5.9 质粒pCT8252
• 1.5.10 质粒pCT6880
• 1.6 本章总结
• 参考文献
• 第二部分 蜡状芽胞杆菌群中规律成簇间隔短回文重复序列的分析
• 2.1 摘要
• 2.2 Abstract
• 缩略语
• 2.3 前言
• 2.3.1 规律成簇的间隔短回文重复序列的基本结构与作用机制
• 2.3.1.1 重复序列
• 2.3.1.2 间区序列
• 2.3.1.3 前导序列
• 2.3.1.4 cas基因
• 2.3.1.5 作用机制
• 2.3.2 蜡状芽胞杆菌群
• 2.3.3 研究目的和意义
• 2.4 材料与方法
• 2.4.1 实验数据
• 2.4.2 实验材料
• 2.4.2.1 菌株来源
• 2.4.2.2 培养基配制及主要成分
• 2.4.2.3 主要仪器
• 2.4.2.4 主要试剂
• 2.4.3 实验方法
• 2.4.3.1 生物信息学分析
• 2.4.3.2 细菌总RNA抽提
• 2.4.3.3 RT-PCR
• 2.4.3.4 PCR扩增
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 10株蜡状芽胞杆菌群菌株中CRISPR概况
• 2.5.2 前导序列
• 2.5.3 重复序列
• 2.5.4 间区序列和cas基因
• 2.5.5 苏云金芽胞杆菌CT-43中cas基因的转录分析
• 2.6 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录