玉米产量性状QTL定位与株型性状相关基因克隆

论文摘要

高产是玉米育种的永恒主题和方向。我国玉米育种和生产实践表明,选育和推广抗耐高密度逆境的高产玉米杂交种,是实现玉米增产的重要途径。健壮的根、茎、叶合理分布是玉米单株间竞争小、雌雄穗发育协调、结实性好的内在机制。而紧凑株型建成是当前群体大、结实好、耐密植玉米新品种单产增加的根本原因。玉米产量是其构成因素出籽率、籽粒深度、百粒重等共同作用的结果,这些因素既是决定产量的重要性状,也是玉米抗耐田间高密度群体逆境条件的重要指标。因此,研究玉米产量构成因素及株型建成相关性状的基因效应、分子遗传机理,对于定向遗传改良和优良基因聚合,制定玉米分子育种方案,以及抗耐高密度逆境的高产玉米新品种选育具有重要的理论和实践意义。本研究以玉米紧凑型自交系豫82和平展型自交系沈137为材料,通过构建F2:3家系群体对产量相关性状进行QTL定位及效应分析;利用同源克隆的方法分别克隆了调控水稻株型建成基因OsLIC及OsDwarf同源的玉米ZmLIC及ZmDwarf2基因;对玉米ZmLIC及ZmDwarf2基因进行了初步染色体定位以及功能推测;利用实时荧光定量PCR法研究了ZmLIC及ZmDwarf2基因的表达模式,分析了不同自交系不同发育时期各器官的表达情况,试图明确ZmLIC及ZmDwarf2基因之间的表达关系;构建了ZmLIC基因35S融合表达载体,并对ZmLIC基因进行了亚细胞定位研究;构建了ZmLIC基因的过量表达载体,通过农杆菌浸染花序法转化拟南芥,得到了转基因一代植株。主要研究结果如下:1.以豫82×沈137组配的229个F2:3家系为作图群体,构建了具有222个SSR标记的遗传连锁图谱,图谱总长度为1864.7cM,两标记间平均距离为8.40cM。采用复合区间作图法,对3个环境下F2:3家系产量相关性状表型值的均值进行了QTL定位分析,共检测到15个QTL;其中,控制出籽率、籽粒深度、百粒重的QTL分别为3个、3个和4个,它们的联合贡献率分别为35.5%、28.1%和39.0%。尤其是位于第1染色体上介于标记为umc1335与umc2236之间控制出籽率的QTLqSP1b和介于标记umc1508与umc2235之间控制籽粒深度的QTL qKD1,分别解释18.9%和9.2%的表型变异,第9染色体上控制百粒重的qKW9b具有较大的贡献率和效应值。2.利用同源克隆等方法,首次成功克隆了玉米ZmLIC基因,GeneBank登录号为HQ619957,该基因cDNA序列全长1387bp,开放阅读框1206bp可编码401个氨基酸。BLAST分析发现,ZmLIC与水稻OsLIC位于同一进化分枝,其亲缘关系最近,同源性达74%;蛋白结构预测显示其蛋白含有OsLIC典型的CCCH-型锌指蛋白结合域,表明ZmLIC基因是OsLIC的同源基因。3.荧光定量PCR研究表明,豫82、沈137中ZmLIC基因表达趋势基本一致,为3-5叶期表达量低,6-12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量又渐下调。其中,就不同器官而言,豫82、沈137叶枕处,基因ZmLIC表达量相对最低,其次为叶鞘。就不同自交系而言,除叶片以外的其它器官中,豫82的表达量较沈137高。4.成功构建了玉米ZmLIC基因的35S融合表达载体并通过基因枪轰击,使其在洋葱表皮瞬时表达,结果表明,ZmLIC基因具有质、核定位功能;构建了过量表达载体1391-Shen137-ZmLIC,且将该基因转入野生型拟南芥,对阳性候选转基因的PCR鉴定表明,已经成功将该基因转入拟南芥。5.利用同源克隆等方法,首次成功克隆了玉米ZmDwarf2基因,GeneBank登录号为HQ619956,该基因cDNA序列全长1501bp,开放阅读框1398bp可编码465个氨基酸。BLAST分析发现,ZmDwarf2与水稻OsDwarf位于同一进化分枝,其亲缘关系最近,同源性达84%;蛋白结构预测显示其蛋白含有OsDwarf典型的细胞色素P450加氧蛋白结合域,表明ZmDwarf2基因是OsDwarf的同源基因。6.实时荧光定量PCR研究表明,豫82、沈137中ZmDwarf2基因表达趋势基本一致,为3-4叶期表达量低,8-12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量渐降。其中,就不同器官来说,豫82、沈137叶枕处,基因ZmDwarf2表达量相对最高,而叶鞘处,基因ZmDwarf2表达相对最低。就不同自交系而言,沈137在叶片、叶枕、叶鞘、茎尖等器官中表达量较豫82高。7.两基因间的表达关系研究表明,豫82各器官中基因ZmLIC表达量总体较基因ZmDwarf2高,而沈137叶枕中,基因ZmLIC表达量总体较基因ZmDwarf2低;基因ZmLIC对ZmDwarf2通过上位性互作协同调控BR生物合成进程,进而影响玉米植株形态建成。

论文目录

致谢

摘要

第一章文献综述

1 玉米产量及株型相关性状研究意义

1.1 玉米产量相关性状研究意义

1.2 玉米株型相关性状研究意义

2 玉米产量相关性状的研究进展

2.1 玉米产量相关性状经典遗传学研究

2.2 玉米产量相关性状QTL 定位研究

3 分子标记技术在植物研究中的应用

3.1 遗传标记的发展

3.1.1 形态标记

3.1.2 细胞学标记

3.1.3 蛋白质标记

3.1.4 DNA 标记

3.2 分子标记技术在植物遗传育种中的应用

3.2.1 分子遗传图谱的发展

3.2.2 品种DNA 指纹鉴定与遗传多样性

3.2.3 农艺性状相关基因的定位

3.2.4 分子标记辅助选择育种

4 QTL 定位原理与方法及研究概况

4.1 作图群体

4.1.1 初级作图群体

4.1.2 次级作图群体

4.1.3 高级作图群体

4.2 QTL 定位的方法

4.2.1 单区间作图法

4.2.2 复合区间作图法

4.2.3 多区间作图法

4.2.4 基于混合线性模型的复合区间作图法

4.2.5 条件 QTL 分析和 QTL 的动态定位

4.2.6 上位性及与环境互作分析

4.2.7 QTL 精细定位

4.2.8 QTL 的克隆

5 玉米株型相关性状经典遗传学研究进展

6 玉米株型相关性状 QTL 定位研究进展

7 植物株型建成相关途径及其作用基因的研究进展

7.1 生长素（IAA）生物合成调控植物株型建成研究概况

7.2 赤霉素（GA）生物合成调控植物株型建成研究概况

7.3 油菜素内酯（BR）生物合成调控植物株型建成研究概况

8 植物基因克隆技术的研究进展

8.1 功能克隆

8.2 表型克隆

8.2.1 差异筛选法

8.2.2 mRNA 差异显示技术

8.2.3 抑制性缩减杂交技术

8.3 图位克隆

8.4 转座子标签和 T-DNA 插入标签技术

8.5 同源性克隆技术

8.6 电子克隆

9 实时荧光定量 PCR 技术

10 亚细胞定位研究

11 植物转基因方法研究概况

11.1 农杆菌介导法

11.2 基因枪法

11.3 花粉管通道法

12 本研究的目的和意义

第二章玉米产量相关性状的 QTL 定位

引言

1 材料与方法

1.1 试验材料及田间试验设计

1.1.1 供试材料

1.1.2 田间试验设计

1.2 性状调查

1.3 统计分析

1.3.1 描述性统计分析

1.3.2 方差分析、相关分析与遗传力分析

1.4 基因型分析及分子标记遗传连锁图谱构建

1.4.1 DNA 提取和与纯化

1.4.2 SSR 分析

1.4.3 遗传连锁图谱的构建

1.5 QTL 定位及效应分析

2 结果与分析

2.1 双亲、F1及F2:3家系表型分析

2.2 产量相关性状的遗传力及相关分析

2.3 F2:3家系遗传连锁图谱的构建

2.4 玉米产量相关性状QTL 及其效应分析

3 结论与讨论

3.1 QTL 定位的准确性

3.2 QTL 定位的一致性

3.3 调控出籽率、籽深、百粒重的重要区域

3.4 结论

第三章玉米株型性状相关基因ZmLIC 的克隆及功能分析

引言

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 田间试验

1.3 试剂、仪器及相关软件

1.4 实验方法

1.4.1 总 RNA 的提取与纯化

1.4.2 cDNA 第一链的合成

1.4.3 玉米ZmLIC 基因片段的克隆

1.4.4 分析测序结果

1.4.5 染色体定位初步分析

1.4.6 荧光定量 PCR 引物的设计

1.4.7 标准品的制备和标准曲线的建立

1.4.8 样品检测与数据处理

1.4.9 亚细胞定位实验方法

1.4.10 拟南芥过量表达实验

2 结果与分析

2.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测

2.2 玉米ZmLIC 基因序列分析

2.2.1 玉米ZmLIC 基因PCR 扩增

2.2.2 豫82 和沈137 ZmLIC 基因cDNA 序列比较分析

2.2.3 基因ZmLIC 开放阅读框及氨基酸序列分析

2.3 基因ZmLIC 染色体初步定位

2.4 基因表达标准曲线的建立

2.4.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测

2.4.2 荧光定量 PCR 引物的优化和确定

2.4.3 标准曲线鉴定

2.4.4 标准曲线建立

2.5 基因ZmLIC 实时荧光定量表达分析

2.5.1 基因 ZmLIC 在豫82 中mRNA 转录水平表达分析

2.5.2 基因 ZmLIC 在沈137 中mRNA 转录水平表达分析

2.5.3 基因 ZmLIC 在豫82、沈137 不同器官中mRNA 转录水平表达分析

2.6 融合表达载体的构建

2.7 洋葱表皮瞬时表达结果

2.8 植物超表达载体的构建

2.9 重组质粒1391-ZmLIC 的农杆菌转化结果

2.10 转基因拟南芥实验结果

2.10.1 转基因植株筛选

3 结论与讨论

3.1 玉米ZmLIC 基因是OsLIC 基因的同源基因

3.2 玉米ZmLIC 基因的染色体初步定位

3.3 基因ZmLIC 时空表达分析

3.4 玉米ZmLIC 基因具有质、核定位功能

3.5 玉米ZmLIC 基因的功能预测及下一步研究

第四章玉米株型性状相关基因ZmDwarf2 的克隆及功能分析

引言

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 田间试验

1.3 试剂、仪器及相应软件

1.4 试验方法

1.4.1 总 RNA 的提取与纯化

1.4.2 cDNA 第一链的合成

1.4.3 玉米 ZmDwarf2 基因片段的克隆

1.4.4 分析测序结果

1.4.5 染色体定位初步分析

1.4.6 荧光定量 PCR 引物的设计

1.4.7 标准品的制备和标准曲线的建立

1.4.8 样品检测与数据处理

2 结果与分析

2.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测

2.2 玉米ZmDwarf2 基因序列分析

2.2.1 玉米ZmDwarf2 基因 PCR 扩增

2.2.2 豫82 和沈137 中ZmDwarf2 基因cDNA 序列比较分析

2.2.3 基因ZmDwarf2 开放阅读框及氨基酸序列分析

2.3 基因ZmDwarf2 染色体初步定位

2.4 基因表达标准曲线的建立

2.4.1 RNA 提取、纯化、第一链合成及检测

2.4.2 荧光定量 PCR 引物的优化和确定

2.4.3 标准曲线鉴定

2.4.4 标准曲线建立

2.5 基因ZmDwarf2 实时荧光定量表达分析

2.5.1 基因ZmDwarf2 在豫82 中mRNA 转录水平表达分析

2.5.2 基因ZmDwarf2 在沈137 中mRNA 转录水平表达分析

2.5.3 基因ZmDwarf2 在豫82、沈137 不同器官中mRNA 转录水平表达分析

2.6 玉米株型建成中 BR 生物合成相关基因ZmDwarf2、ZmLIC 的表达分析

2.6.1 基因ZmDwarf2、ZmLIC 在豫82 不同器官中mRNA 转录水平表达分析

2.6.2 基因ZmDwarf2、ZmLIC 在沈137 不同器官中mRNA 转录水平表达分析

2.6.3 沈137、豫82 在不同生育时期中叶夹角变化趋势

3 结论与讨论

3.1 玉米ZmDwarf2 基因是OsDwarf 基因的同源基因

3.2 玉米ZmDwarf2 基因染色体初步定位

3.3 基因ZmDwarf2 时空表达规律分析

3.4 基因ZmDwarf2 与基因ZmLIC 的mRNA 水平表达模式探析

参考文献

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