结核分枝杆菌免疫优势抗原蛋白PPE68的制备及血清学诊断的研究

论文摘要

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种能在人类、家畜、家禽、野生动物（如鹿、羚羊、獾和各种野鸟）之间传播的疾病。20世纪以来，由于人口剧增、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、免疫抑制剂的使用等原因，结核病日益严重，在全球范围内又死灰复燃，成为传染病的首位杀手。目前，结核诊断的金标准仍是临床检查结合细菌培养和涂片直接镜检再辅以X线检查。这些方法均依赖于病人的临床症状，因而不可能发现亚临床感染的早期病人。因此，结核病的快速、准确诊断，是全球控制结核病的重要措施。寻找到结核分支杆菌的特异性抗原，对于结核病的诊断具有重要意义。RD1区是卡介苗减毒传代过程中最先缺失的一段区域，它与结核分枝杆菌毒力相关，因为该区基因所编码的蛋白能被宿主免疫系统高度识别，目前大家对结核分枝杆菌诊断试剂的研究主要集中在RD1区，RD1区一共编码9个蛋白，PPE68是由位于该区的Rv3873所编码的蛋白。研究表明PPE68能够被淋巴细胞所识别，激发出强烈的细胞免疫，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导大量IIFN-γ产生，可以认为PPE68是除ESAT-6和CFP-10以外的第3种重要的免疫优势抗原。本研究利用PCR技术从结核杆菌H37Rv国际标准株中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGRv3873并转化大肠杆菌JM109，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后Western blot鉴定，鉴定成功后采用谷胱苷肽—S—转移酶融合蛋白纯化试剂盒对rPPE68进行纯化，SDS-PAGE鉴定纯化的rPPE68，然后将rPPE68免疫新西兰大白兔，制备rPPE68多克隆抗体，建立起以PPD、rPPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法，为了能进一步区分病人是否为现症感染，本实验建立了兔抗rPPE68多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，为结核病的早确诊、早治疗提供了一种新的技术思路。在另一方面，本研究将Rv3873基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建成Rv3873基因真核表达载体，为进一步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础．在另一方面，本研究将Rv3873基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建成Rv3873基因真核表达载体，为进一步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。本研究共分五部分进行：1．通过设计结核分枝杆菌Rv3873特异性引物，用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv国际标准株中扩增出目的基因Rv3873，克隆入高效原核表达载体pGEX-4T-1中，成功构建原核重组质粒pGRv3873。2．原核重组质粒pGRv3873，经IPTG诱导，成功表达出约63kDa的rPPE68融合蛋白，并对蛋白进行了包涵体溶解，使其变为可溶性蛋白。3．纯化rPPE68融合蛋白，用它免疫新西兰大白兔，成功制备到特异性、高效价的兔抗rPPE68多克隆抗体。4．以结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白rPPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法．分别检测到PPD、rPPE68的灵敏度为57％、30％，特异性为73.6％、92.7％，分析后认为，rPPE68与PPD比较，在结核病的诊断上显示了更高的特异性，但是灵敏度却欠佳。本部分研究还建立了以包被多克隆抗体检测结核特异性抗原的双抗体夹心ELISA方法，经检测发现，抗rPPE68的灵敏度较低，只有13％，特异性却很高，达到93.6％，认为以结核特异性抗体来检测病人血清中的结核特异性抗原的ELISA检测方法是一种诊断是否为结核现症感染的可行的新技术方法。5．将pGRv3873中目的基因Rv3873亚克隆入pcDNA3.1（+）真核表达载体，成功构建真核重组质粒pcRv3873，为进一步研究该基因的免疫原性和免疫保护性奠定了基础。综上所述，本研究选择结核分枝杆菌RD1区Rv3873编码蛋白PPE68为研究目的蛋白，以此制备得到多克隆抗体，建立起ELISA方法对结核患者血清、健康人群血清以及其他非结核肺病患者血清进行检测，通过与PPD检测上述人群的对比，为结核杆菌血清学的诊断提供了重要的实验数据。结果说明rPPE68与抗rPPE68单独进行诊断研究意义不大，但是可以把它作为结核血清学组合候选抗原之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 结核分枝杆菌PPE68蛋白编码基因Rv3873原核表达质粒的构建
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3.结果
• 3.1 结核分枝杆菌结核分枝菌Rv3873基因的PCR扩增
• 3.2 转化后阳性重组克隆的筛选
• 3.3 pGRv3873的PCR及限制性酶切鉴定
• 3.4 Rv3873基因序列测定结果
• 4.讨论
• 5.小结
• 第二部分 结核分枝杆菌PPE68蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 3.2 重组蛋白表达形式和溶解性分析
• 3.3 免疫印迹检测结果
• 4.讨论
• 5.小结
• 第三部分 结核分枝杆菌PPE68蛋白多克隆抗体的制备
• 1.引言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3.结果
• 3.1 重组蛋白的纯化
• 3.2 纯化的重组蛋白的浓度测定
• 3.3 抗体效价的检测结果
• 3.4 纯化重组蛋白的的免疫印迹检测
• 4.讨论
• 5.小结
• 第四部分 结核分枝杆菌特异性蛋白抗原、抗体ELISA检测方法的建立及初步应用
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3.结果
• 3.1 PPD-ELISA最佳反应条件的确立
• 3.2 结核分枝杆菌特异抗体ELISA检测方法的建立
• 3.3 结核分枝杆菌特异抗原ELISA检测方法的建立
• 3.4 批内和批间重复性试验
• 3.5 结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测方法的临床应用
• 4.讨论
• 5 小结
• 第五部分 结核分枝杆菌PPE68蛋白编码基因Rv3873真核表达质粒的构建
• 1.引言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 5.小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述 结核分支杆菌实验室诊断的研究进展
• 引言
• 一、细菌学诊断现状
• 二 血清学诊断现状
• （一） 血清学诊断技术的方法
• （二） 特异性抗原的研究状况
• 三.分子生物学诊断现状
• （一） PCR方法
• （二） DNA指纹技术
• （三） 基因芯片技术（gene chip）
• 参考文献
• 在读期间发表的论文情况
• 致谢