融合基因VP4-ST及K88-ST在烟草中的表达

论文摘要

轮状病毒（Rotavirus,RV）和产肠毒素大肠埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起幼畜腹泻的主要病原。腹泻流行时可造成畜牧业的重大经济损失。目前疫苗预防仍然是控制此病的最佳选择,但常规疫苗存在死疫苗用量大且效果不好,活疫苗容易造成扩散和环境污染等缺点。转基因植物疫苗的研制,可以改变传统的疫苗接种方式和接种手段,而且可大大降低疫苗的生产成本,具有广阔的应用前景。而轮状病毒VP4和大肠杆菌ST、K88分别是这两种病原的主要保护性抗原或主要致病因子。因此选择轮状病毒VP4蛋白与大肠杆菌热稳定肠毒素ST及大肠杆菌菌毛抗原K88与热稳定肠毒素ST融合蛋白作为合适的抗原,研制抗腹泻的转基因植物口服疫苗具有重大的理论意义和实践意义。 本研究首先将植物表达载体pBLGC改造成了本实验要用的表达载体pBin438,为了便于基因操作,分别将K88-ST及VP4-ST的编码基因进行了适当的修饰和改造,将改造后的基因序列插入到植物表达载体pBin438中,成功的构建了重组表达质粒pBin-VP4-ST及pBin-K88-ST。将pBin-VP4-ST、pBin-K88-ST转入农杆菌EHA105,构建了农杆菌工程菌。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗性筛选,获得两种转基因烟草植株,进一步通过PCR、Southern Blot检测,证实两个目的基因已经分别整合进入烟草的基因组中,然后经Western blot鉴定,证明由目的基因VP4-ST及K88-ST所编码的特异性蛋白在转基因烟草中分别获得了表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号、缩略语词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第二章 实验研究
• 实验一 融合基因VP4-ST、K88-ST植物表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂
• 1.1.3 引物的设计
• 1.1.4 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 VP4-ST及K88-ST融合基因的克隆
• 1.2.2 植物表达载体的构建及重组子的鉴定
• 2.实验结果
• 2.1 目的基因VP4-ST、K88-ST序列的扩增
• 2.2 VP4-ST、K88-ST融合基因的克隆
• 2.3 植物表达载体的构建及重组子的鉴定
• 实验二 融合基因VP4-ST、K88-ST在烟草中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 根癌农杆菌感受态的制备和表达载体的转移
• 1.2.2 根癌农杆菌介导的烟草的转化和再生
• 1.2.3 转基因烟草植株的PCR检测
• 1.2.4 转基因烟草的Southern blot检测
• 1.2.5 转基因烟草的western blot检测
• 2 实验结果
• 2.1 植物表达载体转化农杆菌及重组子的鉴定
• 2.2 烟草的转化和转基因植株的筛选
• 2.3 转基因烟草植株的PCR检测
• 2.4 转基因烟草的Southern blot检测
• 2.5 转基因烟草的Western blot检测
• 第三章 讨论
• 1 关于PCR
• 2 关于表达载体的构建
• 3 关于烟草的转化和再生
• 4 关于转基因烟草的检测
• 5 下一步工作设想
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 导师评阅表