GnRH多肽免疫去势疫苗在大鼠体内的残留及免疫去势动物肉品安全的研究

论文摘要

自20世纪60年代末，在免疫学、生物化学、内分泌学等学科的基础之上，逐渐兴起一门边缘学科——激素免疫学，为探讨取代动物传统外科阉割的新方法提供了新的思路。国内外一些学者研究发现，将合成的GnRH多肽与适当大分子载体蛋白偶联后主动免疫动物，动物体内将产生抗GnRH抗体，并特异性中和内源性GnRH，导致GnRH生物活性全部或部分丧失，进而阻断下丘脑-垂体-性腺轴之间的正常反馈调节关系，引起内分泌平衡改变，从而在一定时间内使动物性腺发育受到影响，达到去势目的。近年来，国内外一些学者开展了GnRH主动免疫对猪、牛、羊、鸡等畜禽去势效果的研究，取得了一定的进展。然而，消费者亦担心GnRH多肽疫苗在动物体内是否存在残留，以及免疫去势动物肉品是否安全。针对广大消费者的担心，本文开展了相关研究，并获得以下结果：1、采用双相氯胺-T法对新蛋白构型的GnRH并列体二聚物（GnRH-TDK）进行放射性碘标记，用三氯乙酸沉淀法和γ计数探测仪测定标记物标记率，超滤离心法对标记物进行分离纯化，三氯乙酸沉淀法鉴定标记物的放化纯度，并检测标记物在大鼠体内的免疫活性。结果表明：采用该方法标记GnRH并列体二聚物，可获得高标记率（78.69％）、高放化纯度（＞90％）、比放射性适中（1.94×105Bq.μg-1）的标记蛋白，且蛋白活性不受放射性碘化标记的影响。2、应用同位素示踪的方法研究GnRH多肽去势疫苗在大鼠体内的组织分布以及粪尿排泄规律，以研究该疫苗在大鼠体内的残留情况。结果显示：（1）免疫后24天注射部位肌肉有少量疫苗残留（0.45±0.23μg／g），免疫后44天注射部位肌肉抗原接近不可测水平，体内其他组织均无疫苗蓄积滞留；（2）免疫后25天疫苗经粪尿排泄量累计占引入量的比例为49.30±9.07％，其中以尿液排泄为主（34.62±3.77％），大部分疫苗通过免疫反应和其他代谢转化途径消除。3、应用蛋白结构修饰后的促性腺激素释放激素并列体二聚物（G6k-GnRH-Tandem-Dimer）免疫公兔，获得去势效果良好的免疫动物。将免疫去势兔肉添加到大鼠饲料中，或直接灌喂免疫原和抗血清，连续饲喂8周，对大鼠的生殖性能进行评价。结果表明，食用免疫去势动物肉后大鼠的睾酮水平、睾丸发育和性行为表现与对照组无明显差别，生殖健康状况良好。

论文目录

• 中文摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1.GnRH概述
• 2.GnRH免疫去势的机理
• 3.GnRH免疫在肉用畜禽去势中的应用
• 3.1 猪
• 3.2 牛
• 3.3 羊
• 3.4 鸡
• 3.5 其他
• 4.GnRH免疫存在的问题及前景展望
• 4.1 GnRH免疫存在的问题
• 4.2 前景与展望
• 5.本试验的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 GnRH并列体二聚物（GnRH-TDK）的放射性碘标记
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品与试剂
• 1.1.2 试验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 标记反应
• 1.2.2 标记率的测定
• 1.2.3 标记物的分离纯化
• 1.2.4 放化纯的测定
• 1.2.5 蛋白质定量
• 1.2.5.1 试剂的准备
• 1.2.5.2 标准曲线绘制
• 1.2.5.3 样品测定
• 1.2.6 免疫活性鉴定
• 1.2.6.1 免疫动物
• 1.2.6.2 睾丸大小、重量测定及组织切片
• 2.结果与分析
• 2.1 放射性碘标记率
• 2.2 比放射性
• 2.3 蛋白质纯化及蛋白质含量
• 2.4 放化纯度
• 2.5 免疫活性
• 2.5.1 睾丸大小
• 2.5.2 睾丸组织学分析
• 3.讨论
• 3.1 蛋白质多肽的放射性碘标记方法
• 3.2 标记蛋白的分离纯化
• 3.3 放化纯度鉴定
• 3.4 生物学活性鉴定
• 参考文献
• 第三章 GnRH-TDK-OVA在大鼠体内的残留
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂和药品
• 1.1.2 试验仪器
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 组织分布试验
• 1.2.2 粪尿排泄试验
• 1.2.3 统计分析
• 2.结果与分析
• 125I-GnRH-TDK-OVA在大鼠体内的组织分布'>2.1¹²⁵I-GnRH-TDK-OVA在大鼠体内的组织分布
• 125I-GnRH-TDK-OVA在大鼠粪尿中的排泄'>2.2¹²⁵I-GnRH-TDK-OVA在大鼠粪尿中的排泄
• 3.讨论
• 3.1 残留的检测方法
• 3.1.1 检测方法的选择
• 3.1.2 同位素的选择
• 3.2 组织分布
• 3.3 粪尿排泄
• 参考文献
• 第四章 新蛋白构型GnRH免疫去势疫苗对公兔生殖性能的影响
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试剂和药品
• 1.1.2 仪器
• 1.2 试验动物
• 1.3 方法
• 1.3.1 免疫
• 1.3.2 血清睾酮浓度测定
• 1.3.2.1 血样采集
• 1.3.2.2 睾酮浓度测定
• 1.3.3 体重测量及性行为观察
• 1.3.4 睾丸大小、重量测定及组织切片观察
• 1.3.4.1 睾丸大小、重量测定
• 1.3.4.2 组织切片观察
• 1.3.5 精液质量测定
• 1.3.6 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 血清睾酮含量
• 2.2 体重测定和性行为观察
• 2.3 睾丸的发育
• 2.3.1 睾丸重量和体积
• 2.3.2 睾丸组织学结构
• 2.4 精液质量
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 免疫去势动物肉品安全试验
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.1.3 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 分组饲养
• 1.2.2 血清睾酮浓度测定
• 1.2.3 大鼠生长及性行为观察
• 1.2.4 睾丸大小、重量测定及组织切片观察
• 1.2.4.1 睾丸大小、重量测定
• 1.2.4.2 组织切片观察
• 2.结果与分析
• 2.1 血清睾酮浓度
• 2.2 大鼠生长及性行为
• 2.3 睾丸大小、重量及组织学结构
• 2.3.1 睾丸大小、重量
• 2.3.2 睾丸组织切片
• 3.讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文