苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究

论文摘要

目前，苏云金芽孢杆菌（简称BT）是世界上应用最广的微生物农药，占总量的90%，已在60多个国家生产了120多种产品，是生物农药开发与研究的热点。近年来蛋白质组学迅猛发展，其研究的技术手段日趋成熟与多样，尤其是现代分析技术中的高效液相色谱和质谱技术。为了高效，准确地分离分析苏云金芽孢杆菌中的有效杀虫成分，本论文使用高效液相色谱和生物质谱技术，对国内市售的苏云金芽孢杆菌杀虫粉剂进行快速的分离测定。论文共分为四章，主要工作内容：第一章对苏云金芽孢杆菌进行了概述，介绍了杀虫晶体蛋白的种类、结构、杀虫机理和分类，以及对杀虫晶体蛋白的研究现状，同时介绍了蛋白质组学及其研究技术，并对课题的研究工作进行了概述。第二章主要目的是获得苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的冻干粉。首先考察了杀虫晶体蛋白样品溶解与沉淀的条件，进一步优化了透析沉淀法提取杀虫晶体蛋白所需的缓冲液浓度和缓冲沉淀时间，通过将碱溶后BT蛋白的离心上清液置于透析袋中，在含有1mM EDTA、pH值为4.5、100mM的CH3COONaCH3COOH缓冲液里，透析5小时的透析沉淀法，并冷冻干燥制到杀虫晶体蛋白的冻干粉。第三章主要通过RPLC实现了对杀虫晶体蛋白的快速分离。先利用蛋白变性的方法，使杀虫晶体蛋白在溶液中的性质发生改变，以满足反相液相色谱分离的上样条件，再依据中心切割法将色谱分离中的目标蛋白组分进行收集浓缩，并使用SDS-PAGE凝胶电泳对收集浓缩的蛋白组分进一步分离分析。第四章分别利用MALDI-TOF-MS质谱和LTQ ORBITRAP XL质谱串联质谱技术对凝胶上蛋白条带胰酶酶切后的多肽样品进行检测，针对一级质谱图和二级串联质谱图提取的数据信息，分别进行肽质量指纹图谱搜索和MS/MS数据多肽序列蛋白数据库搜索；最终鉴定到24个苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白中Cry1A类蛋白的多肽序列，其中肽段AVNALFTSTNQIGLK氨基酸序列在整个Bacillusthuringiensis蛋白数据库中只匹配上一个蛋白gi169788589-pesticidal crystalprotein cry1Ac [Bacillus thuringiensis serovar kurstaki]，另一个氨基酸序列EIYTNPVLEDFNGSFR在Bacillus thuringiensis蛋白数据库中也只匹配于一个蛋白gi46409861-cry1Atype crystal protein [Bacillus thuringiensis serovar kenyae]，而其余氨基酸序列同时为几十个Cry类杀虫蛋白所共有。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 论文综述
• 1.1 苏云金芽孢杆菌
• 1.1.1 苏云金芽孢杆菌概述
• 1.1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白概述
• 1.1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白研究现状
• 1.2 蛋白质组学研究内容及主要技术手段
• 1.2.1 蛋白质组学的研究背景
• 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术手段
• 1.3 本论文的研究工作
• 第二章 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白透析沉淀法的分离纯化
• 摘要
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 样品来源
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的完全沉淀条件的确定
• 2.3.2 透析法提取苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的条件优化
• 2.3.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体的分离提纯
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白完全沉淀的 pH 值结果
• 2.4.2 透析法提取苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的优化结果
• 2.4.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的提取方法的讨论
• 2.5 结论
• 第三章 BT 杀虫晶体蛋白的反相液相色谱分离
• 摘要
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 样品来源
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 色谱进样前苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的多种预处理方法
• 3.3.2 用于高效液相色谱分析的杀虫晶体蛋白预处理
• 3.3.3 高效液相色谱分离
• 3.3.4 垂直平板 SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 杀虫晶体蛋白色谱进样前预处理方法的优化与讨论
• 3.4.2 反相液相色谱流动相的选择
• 3.4.3 反相高效液相色谱分离的结果
• 3.4.4 反相液相色谱分离蛋白组分的情况
• 3.4.5 色谱收集组分 SDS-PAGE 凝胶电泳的结果与分析
• 3.5 结论
• 第四章 SDS-PAGE 凝胶中杀虫晶体蛋白的质谱鉴定
• 摘要
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 样品来源
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 胶内蛋白的酶切
• 4.3.2 MALDI-TOF-MS 质谱检测
• 4.3.3 MALDI-TOF-MS 质谱数据的数据库检索
• 4.3.4 液质联用中液相部分的参数条件：
• 4.3.5 LTQ ORBITRAP XL 质谱检测
• 4.3.6 LTQ ORBITRAP XL 质谱数据的检索
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 蛋白质条带的 MALDI-TOF-MS 肽质量指纹分析
• 4.4.2 SDS-PAG 凝胶中蛋白多肽的二级质谱测定与序列查询结果
• 4.4.3 差异蛋白质的鉴定分析
• 4.4.4 多肽氨基酸序列与其所属蛋白的关系
• 4.4.5 ICPS 蛋白 MALDI-TOF-MS 质谱与 LTQ ORBIRAP XL 质谱检测数据结果的比较
• 4.5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 已发表论文目录