Arthrobacter.sp SYBC La1产转糖基β-半乳糖苷酶发酵条件优化及酶学性质研究

论文摘要

乳果糖是人工合成的含酮双糖,其化学名为4-O-β-吡喃型半乳糖-D-果糖。可以乳糖为材料通过化学法合成,乳果糖对肠道内的双歧杆菌有特殊的增殖效果,乳果糖在医药方面主要作为缓泻剂及用于治疗血氨过高。目前乳果糖的生产主要通过碱液处理将乳糖异构成乳果糖,而减法处理产生的副产物的分离纯化成本很高。采用酶法合成乳果糖可利用β-半乳糖苷酶。分离纯化过程简单,可大大降低生产成本。本文以乳糖为唯一碳源,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）为显色剂,从土壤中筛选出10个高产β-半乳糖苷酶的菌株,在pH7.0（10 mmol/L）磷酸钾缓冲液中加入400 g/L乳糖和200 g/L果糖,添加β-半乳糖苷酶至酶活为400 U/L,在35℃情况下反应8 h,经高压液相色谱分析,编号为2-1样品含有乳果糖。克隆并分析了该菌株16S rDNA基因片段,经16S rDNA序列同源性分析结果,确定该菌株为节杆菌属,命名为Arthrobacter sp SYBC La1。对Arthrobacter sp SYBC La1产β-半乳糖苷酶的摇瓶发酵培养基和发酵条件进行了研究。确定其适宜的发酵培养基组成为（g/L）:甘油20,酵母膏14,Fe3+ 1.5 mmol/L,初始pH为6.5。适宜的发酵条件为:种龄10 h,装液量30 mL/250 mL,接种量12 %（v/v）,摇瓶发酵时间16 h,培养温度25℃。优化前菌株Arthrobacter sp SYBC La1的β-半乳糖苷酶酶活为0.322 U/mL,优化后酶活达到0.688 U/mL,提高了1.07倍。β-半乳糖苷酶纯化酶的最适pH为6.5,在pH 5.5-pH8范围内稳定性较好,相对酶活均超过50 %。β-半乳糖苷酶的最适温度为30℃,该酶不耐高温,当温度高于50℃时酶活迅速下降。1.0 mmol/L的Mn2+对酶活有显著的激活作用。K+、Zn2+、Mg2+等对酶活有一定程度的激活作用,Cu2+对酶活有明显的抑制作用,粗酶液通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶柱层析后,酶的纯化倍数达到22.34倍,回收率达到20.5%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 乳果糖
• 1.1.2 乳果糖的作用
• 1.1.3 乳果糖的生产
• 1.1.4 β-半乳糖苷酶
• 1.1.5 β-半乳糖苷酶的来源
• 1.1.6 β-半乳糖苷酶性质
• 1.1.7 β-半乳糖苷酶转苷反应机理
• 1.1.8 β-半乳糖苷酶的生产
• 1.1.9 β-半乳糖苷酶的应用
• 1.2 国内外研究进展
• 1.3 立题依据
• 1.4 研究内容
• 第二章 具有β-半乳糖苷酶转苷能力产生菌的筛选和鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 转糖基β－半乳糖苷酶产生菌的筛选
• 2.3.2 高压液相色谱分析结果
• 2.3.3 菌株2-1 的形态学及生理生化特征
• 2.3.4 菌株2-1 的16S rDNA 序列分析
• 2.4 讨论
• 第三章 β-半乳糖苷酶产酶条件的优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 菌株SYBC La1 种子生长曲线
• 3.3.2 发酵培养基的确定
• 3.3.3 发酵培养基的优化实验
• 3.3.4 发酵培养条件的确定
• 3.3.5 优化发酵条件下菌株SYBC La1 产β-半乳糖苷酶摇瓶发酵曲线
• 3.3.6 优化前后菌株SYBC La1 菌体生长和产酶情况的比较
• 3.4 讨论
• 第四章 β-半乳糖苷酶的分离纯化及纯化酶酶学性质
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 粗酶液的硫酸铵沉淀
• 4.3.2 离子交换层析
• 4.3.3 凝胶柱层析
• 4.3.4 β-半乳糖苷酶纯化结果分析
• 4.3.5 最适pH
• 4.3.6 pH 稳定性
• 4.3.7 最适温度
• 4.3.8 温度稳定性
• 5.3.9 金属离子对酶活的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文