论文摘要
一、研究背景和目的：妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指在妊娠期发生或首次发现的糖尿病。GDM在全球的发病率正在逐年上升，而亚洲女性与其他种族相比发病率较高。GDM是T2DM的高危因素，遗传背景在其发病中也起着重要的作用。根据既往文献报道以及本研究的临床资料分析，胰岛素抵抗是GDM的重要特征。本研究的主要目的是研究GDM孕妇的临床特征，并探讨一种与胰岛素抵抗相关的新型脂肪因子RBP4在DNA水平、RNA水平和蛋白表达水平与GDM的关系。二、研究方法:1)临床资料库的建立Ⅰ．研究对象为2005年9月至2008年3月在北京协和医院就诊并常规产前随诊的中国籍孕妇。孕24-28周行GCT，1 h血浆葡萄糖浓度≥7．8mmol/L的孕妇，一周后行100g OGTT，GDM诊断标准为ADA标准。共纳入1595人，其中GCT1 h血浆葡萄糖浓度<7.8 mmol/L即GCT阴性孕妇290人，GDM共488人，IGT共235人，NGT582人。Ⅱ.一般性资料在首次产检（孕13-15周）时获得。包括年龄、孕产史、孕前体重、身高、收缩压、舒张压、既往史、糖尿病家族史、血白细胞总数（WBC）、血清丙氨酸转氨酶（ALT）、血清白蛋白（ALB）、血清肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）等。Ⅲ.OGTT试验同时分别于0h、1h、2h、3h测定血浆血糖、真胰岛素，0h测定CHO、TG、HDL、LDL、CRP及HbAlc。2)SNP分型:Ⅰ．病例组共分型505例（其中GDM 342例，IGT 163例），对照组共分型687例（其中NGT 401例，GCT阴性286例）Ⅱ．提取血液基因组DNA，PCR技术得到目的片断。Ⅲ．用LDR方法对RBP4基因rs 3758538（-1265A>C），rs 3758539（-803G>A），rs 12265684（+6969C>G），rs 10882273（+11881T>C）的SNP进行分型。Ⅳ．用直接测序法进行证实。3)血清RBP4检测Ⅰ.共测定143例孕妇，GDM组为74例，NGT组为69例，均留取OGTT试验时空腹血样（EDTA管留取），分离血清。Ⅱ．RBP4（人）ELISA试剂盒测定血清RBP4水平。4)脂肪组织RBP4的RNA及蛋白表达水平分析Ⅰ.2007年11月至2008年1月收集在我院进行择期剖腹产孕妇的皮下脂肪，共41例，GCT阴性13例、GDM17例、IGT 2例、NGT 9例，仍将NGT与GCT阴性组合并为对照组，GDM+IGT合并为病例组。Ⅱ．GCT阴性组因未采集到血样，从脂肪组织提取基因组DNA，LDR进行SNP分型。Ⅲ．提取总RNA，RT-PCR测定RBP4 mRNA的相对表达水平。Ⅳ．Western blotting测定RBP4蛋白的相对表达水平。三、研究结果1．临床资料部分Ⅰ.从GCT阴性→NGT→IGT→GDM组，随着血糖水平的增高，研究对象的年龄、孕产次、孕前BMI（GCT阴性组未收集到孕前BMI，仅有初次产检时的BMI，因此未纳入两两比较），糖尿病家族史阳性率，初次产检的血压、ALT、WBC总数、以及OGTT检查时的TG、CRP、各点的真胰岛素呈现升高趋势；血BUN、Cr、CHO、HDL、LDL均未见统计学差异。Ⅱ．反映胰岛素敏感性的指标在GDM组→IGT组→NGT组依次降低，而反应β细胞功能的指标在GDM组较IGT及NGT组降低，但IGT和NGT组之间并没有统计学差异且均数十分接近。评价胰岛素敏感性的指标中较为合理的是引入OGTT过程中血糖和胰岛素变化的指标ISI-OGTT指数，而评价β细胞功能的指标中，较为合适的是第1时相胰岛素分泌指数和第2时相胰岛素分泌指数。Ⅲ．在Logistic回归中，孕前BMI升高、TG升高、糖尿病家族史阳性均为发生高血糖的独立危险因素，且危险系数高低排序为糖尿病家族史>TG>孕前BMI。2．SNP分犁部分Ⅰ．HWE平衡检验：无论是在总体人群、病例组或对照组，4个SNP位点均符合HWE。Ⅱ.各SNP位点的病例对照研究：2个SNP位点的等位基因频率和/或等位基因型在病例对照研究中的差异达到了统计学意义，它们是：rs3758539 G vs A，OR=1.446，95％CI 1.095-1.911，P=0．009；rs3758539 GG Vs AG+AA，OR=1．532，95％CI 1．131-2．075；rs12265684 C vs G,OR=1．296，95％CI 1．014-1．658。经过Logistic回归对年龄、孕次、产次、孕前体重、收缩压、舒张压、CHO、TG和糖尿病家族史等因素校正后，3个SNP位点的major homo基因型较hetero+minor homo基因型为GDM的独立危险因素，它们为：rs3758539 GG vs AG+GG,OR=1.832，95％CI1．252-2．680，P=0．002；rs12265684 CC Vs CG+GG OR=1．757，95％CI1．234-2．458，P=0．001；rs10882273，OR=1．678，95％CI 1．189-2．370，P=0．003。Ⅲ．各基因型间临床及生化指标比较：4个SNP位点的基因型分布与年龄、孕前BMI、糖尿病家族史阳性率、血压、胰岛素敏感性和β细胞功能的指标均未发现统计学差异。rs12265684 CC基因型较CG+GG基因型HbA1c升高（5．42±0．53 vs 5．31±0．41,P=0．010）；rs10882273 TT基因型较CT+CC基因型HbA1c也升高（5．42±0．54 vs 5．31±0．42，P=0．021），而rs3758539似乎与血糖水平最为密切，GG基因型较AG+AA基因型，HbA1c、2hOGTT，3hOGTT均升高（HbA1c 5．44±0．52 vs 5．29±0．42，P=0．006，2hOGTT glucoselevel 8．40±1．70 vs 8．11±1．44，P=0．042，3hOGTT glucose level 7．38±1．47 vs7．09±1．17．P=0.009）。Ⅳ．4个SNP位点的LD检验以及单倍体型的病例对照研究：rs3758539与其它位点无连锁关系，而rs375539、rs12265684、rs 10882273这三个位点在1个长约12kb的LD block内，可以进行单倍体型构建。通过Haploview计算得出，4种单倍体型中有2种与GDM有关：GCT单倍体型在病例组分布频率较对照组升高（86．0％vs 82．3％），P=0．016，OR为1．322（1．054-1.659）；AGC单倍体型在病例组分布频率较对照组降低（8．7％vs 11．3％），P=0．038，OR为0．746（0．566-0．985）。Ⅴ.样本量及检验效能的验证：用Quanto软件进行样本量的检验，证实以目前的样本量，我们有>85％的检验效能（P=0．05）统计出MAF>10％，OR值>1．5的等位基因在病例对照组中的差异。3．血清RBP4测定部分Ⅰ.GDM组的RBP4均值较NGT组仅有升高的趋势（21．53±5．96ug/ml vs20．84±4．31ug/ml，P=0．429），经过年龄、孕前BMI、OGTT孕周校正后两者比较没有统计学差异。Ⅱ．血清RBP4水平在rs 3758539、rs 12265684、rs 10882273的major homo基因型均较minor homo+hetero基因型的RBP4水平有升高趋势，但均未见统计学差异。Ⅲ．在相关性分析中，血清RBP4水平和年龄、孕前BMI、TG呈正相关，和ISI-OGTT指数呈现弱负相关（correlation=-0．199，P=0．017）；经多元线性回归分析校正混杂因素，发现与RBP4水平独立相关的指标是TG（标准偏回归系数beta=0．331，P=0．000）和年龄（标准偏回归系数beta=0．194，P=0．018），并以TG与RBP4的关系最为密切。4．脂肪组织RBP4的RNA及蛋白表达部分Ⅰ．脂肪组织RT-PCR结果A)病例组的RBP4 mRNA表达水平较对照组（1．438 vs 1．034，P=0．025，经年龄、孕前BMI校正）有统计学差异的升高。B) RBP4mRNA的表达和rs 3758539基因型的关系：GG型转录活性较AA+AG型有升高的趋势（1．271 vs 1．007，P=0．185），然而P值尚未达到统计学差异。Ⅱ．脂肪组织western blotting结果A)病例组RBP4/β-actin的比值均值略高于对照组（0．779 vs 0．738，P=0．617），P值没有统计学差异。B)与rs 3758539不同基因型的比较：GG型较AG+AA的比值升高（0．774 vs0．695，P=0．419），P值未达到统计学差异。四、结论本研究表明RBP4的rs3758539、rs12265684、rs10882273在一个连锁不平衡的block内，这3个SNP位点均与妊娠期血糖升高有关，其中rs3758539位点G等位基因以及GG等位基因型、rs12265684位点的C等位基因以及CC等位基因型以及rs10882273位点的TT等位基因型均是GDM的易感因素。由3个SNP位点组成的GCT单倍体型为致病型单倍体；AGC单倍体型为保护型单倍体。上述这些结果均表明RBP4的基因多态性与中国妇女的GDM发生相关。在转录水平，发现病例组脂肪组织RBP4mRNA表达水平较对照组升高。在血清RBP4蛋白表达水平及脂肪RBP4蛋白表达水平，病例组虽有升高的趋势但尚未见统计学差异。无论是在血清水平还是脂肪组织RNA或蛋白水平，rs3758539 GG基因型较AA+AG基因型均有升高趋势但未达到统计学差异。