植物谷胱甘肽合成酶（GSHI）的表达纯化及其对温度变化的应答

论文摘要

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶GSHⅠ（γ-glutamylcysteine synthetaseγ-ECS）,又称谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶,是谷胱甘肽（GSH）合成过程第一步的催化酶,由于合成产物GSH可通过反馈抑制调控GSHⅠ的活性,GSHⅠ被认为是GSH生物合成途径中的限速酶（在某些逆境条件下,如在Cd胁迫过程中GSHⅡ（GSH合成酶）可能成为GSH合成途径的限制酶）。本论文将主要对GSHⅠ在温度上的活性变化及其在转录水平上的响应进行初步探索。Ullmann等在1996年首次从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中中克隆了植物GSH合成酶基因。此后,植物谷胱甘肽合成酶基因陆续在豌豆（Pisum sativum）、蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、小麦（Triticumaestivum）和百日菊（Zinnia elegans）等植物中被克隆。Bloch最早证实细胞内的GSH是由GSHⅠ（EC 6.3.2.2）与GSHⅡ（EC 6.3.2.3）在ATP存在下催化L-谷氨酸（Glu）、L-半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）的一个序贯反应合成的。因此,要实现GSH的高效合成,GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给是两个必须满足的条件。细胞内GSHⅠ活性提高使GSH合成加速,从而提高细胞内外GSH浓度。GSHⅠ活性的调节可在基因转录水平、转录后水平、翻译后水平等环节,但主要在基因转录水平。本论文首次尝试在pETM载体系统中进行拟南芥（Arabidopsis thaliana）的GSHⅠ和GSHⅡ的融合和非融合表达。从拟南芥的cDNA文库中分别克隆GSHⅠ和GSHⅡ,采用原核表达技术,将其转入pETM系列原核表达载体中,与载体中的硫氧还蛋白基因（TrxA）相融合,便于融合蛋白表达后的纯化。SDS-PAGE分析表明,只有融合基因GSHⅠ-TrxA通过E coli在适当温度下经IPTG诱导后得到了过量表达的融合蛋白。本论文通过应用实时荧光定量PCR对烟草（Nicotiana megalosiphon）在极限温度胁迫下进行相对定量。结果表明,烟草同拟南芥一样在4℃低温条件下,GSHⅠ被大量诱导表达,但是在40℃时表达受到抑制,表达量降低,其机理有待进一步的研究工作。本实验成功对拟南芥中的GSHⅠ进行了融合表达和纯化,为了对GSHⅠ和GSHⅡ在细胞中的动态研究奠定基础,对在一个质粒中同时表达两个酶做了尝试性的工作,并成功的表达了一个双亚基的酶E.coli Integration Host Factor（IHF）;对在一个载体中同时表达合成链中两个酶积累了实验依据,对载体合成酶系构建提供了良好的基础,也对用构建工程菌表达植物细胞内相互作用或关联的蛋白或酶提供了很好的思路和方法,在植物基因工程研究方面具有重要的意义。同时,本论文首次对能够诱导烟草谷胱甘肽合成酶表达的温度进行了初步探索,证明了GSHⅠ可能具有协同抵御极限温度胁迫的功能,为其在今后提高作物对环境抗逆作用的转基因应用提供了可靠依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 谷胱甘肽概述
• 1.2 自然界中的谷胱甘肽合成酶
• 1.2.1 谷胱甘肽合成酶在细菌中的表达特点
• 1.2.2 谷胱甘肽合成酶在动物中的表达特点
• 1.2.3 谷胱甘肽合成酶在植物中的表达特点
• 1.2.4 拟南芥和烟草中GSHI的序列比对
• 1.3 谷胱甘肽合成酶在代谢中的作用
• 1.3.1 GSH体内生物合成的两步反应
• 1.3.2 谷胱甘肽在自然和胁迫条件下的代谢过程
• 1.4 植物抗寒研究进展
• 1.4.1 酶系统多态性与植物抗寒性
• 1.4.2 抗寒基因的表达和调控与植物抗寒性
• 1.4.3 抗寒基因的诱导因素
• 1.4.4 植物抗寒分子机理发展的展望
• 2 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHI）表达载体的构建
• 2.1 植物材料
• 2.2 Trizol试剂提取总RNA
• 2.2.1 实验准备
• 2.2.2 实验程序
• 2.2.3 RNA质量检测
• 2.3 反转录实验步骤
• 2.4 PCR扩增拟南芥GSHI基因
• 2.5 拟南芥GSHI基因的克隆及测序
• 2.5.1 酶切鉴定pGEM- GSHI载体
• 2.5.2 构建表达载体
• 2.5.3 目的载体（GSHI-pETM20）转化表达菌株高效表达
• 2.5.4 纯化目的蛋白
• 2.6 相关实验方法
• 2.6.1 电转化大肠杆菌
• 2.6.2 碱裂解法提质粒
• 2.6.3 试剂盒进行胶回收步骤
• 2.7 本章小结
• 3 双元载体成功表达实例
• 3.1 大肠杆菌总DNA提取
• 3.2 基于pET28a的特殊引物设计
• 3.3 pET28a-himA载体的构建
• 3.4 pGEM-himD载体的构建
• 3.5 目的载体转化DH5a后的菌落PCR结果
• 3.6 目的载体的酶切鉴定
• 3.7 IHF表达
• 3.8 本章小结
• 4 实时荧光PCR监测烟草谷胱甘肽合成酶（T-GSHI）在温度胁迫下的抗逆作用
• 4.1 荧光定量PCR技术发展史
• 4.2 荧光定量PCR概念
• 4.3 荧光定量PCR与普通PCR的主要区别
• 4.4 荧光定量PCR的方法
• 4.4.1 非特异性SYBR Green I染料法
• 4.4.2 特异性Taqman水解探针法
• 4.5 绝对定量分析
• 4.5.1 绝对定量分析方法的使用条件
• 4.5.2 引物和探针的设计
• 4.6 相对定量分析
• 4.6.1 相对定量分析方法的使用条件
• 4.6.2 相对定量数据处理方法
• 4.6.3 实验结果与数据处理
• 4.7 植物材料的培养
• 4.8 实验设计
• 4.9 探针制备
• 4.9.1 T-GSHI荧光定量PCR引物（T-GSHI-RP）设计与合成
• 4.9.2 内参18sRNA荧光定量PCR引物设计与合成
• 4.10 TRIZOL提取植物总RNA
• 4.10.1 实验器材处理和实验步骤
• 4.10.2 RNA质量检测
• 4.11 两步法realtimePCR先反转录得到各个条件下的cDNA模板
• 4.11.1 各组条件下,RNA浓度及用量
• 4.11.2 反转录体系
• 4.11.3 realtimePCR反应体系和程序
• 4.11.4 GSHI和18sRNA目的产物的溶解曲线
• -△△Ct值法对烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析'>4.12 2^-△△Ct值法对烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析
• 4.12.1 40℃诱导条件下的烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析
• 4.12.2 4℃诱导条件下的烟草叶片组织的GSHI的相对定量分析
• 4.13 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢