番茄类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及功能分析

论文摘要

逆境胁迫是目前农业生产上面临的严峻问题之一,也是蔬菜设施栽培中常见的问题,可导致作物生长发育受抑制,产量和品质降低。当作物生长的外在条件如温度、土壤水分、盐浓度等发生急剧变化或紫外线辐射、某些除草剂等作用于植物时,都会导致植物体内产生大量的活性氧。活性氧可引起蛋白质、膜脂和其他细胞组分的损伤,进而导致细胞及组织死亡。活性氧主要包括过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）、超氧阴离子（O 2）等。叶绿体抗坏血酸过氧化物酶（chlAPX）包括叶绿体基质抗坏血酸过氧化物酶（sAPX）和类囊体膜抗坏血酸过氧化物酶（tAPX ）两种,它对于保护叶绿体和其它细胞组分免受H2O2和由它产生的·OH破坏作用是必须的。因此研究逆境胁迫下APX基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。本研究从番茄叶片中克隆到LetAPX并转化到烟草中,选用野生型烟草（WT）,转正义LetAPX基因株系后代T2-2（+）、T2-3（+）和T2-6（+）,研究了逆境胁迫下过量表达LetAPX基因的烟草后代抗氧化及抗逆性能力的变化。表达模式和功能分析表明,LetAPX基因的表达受多种逆境诱导,低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等逆境条件下过量表达对烟草具有保护作用。主要结果如下:1.利用同源序列设计兼并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体tAPX基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’片段和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长1369 bp cDNA,编码377个氨基酸的多肽。同源序列比较发现,番茄tAPX的序列与烟草、拟南芥的叶绿体APX基因的序列高度同源。该基因命名为LetAPX。2. Northern杂交结果表明,常温下tAPX在番茄叶片中表达水平最高,其次为幼果（青）、茎、花萼,根与花中表达量最少。表达分析表明LetAPX受低温、高温、盐胁迫、水分、H2O2胁迫诱导,其表达水平随逆境处理时间的延长而变化。同时,常温下转基因烟草植株中表达水平高于野生型。3.构建pBI-LetAPX正义表达载体,利用农杆菌介导转化烟草。利用卡那筛选,结合基因组DNA-PCR方法筛选得到转基因植株。测定了低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等胁迫条件下APX酶活性, H2O2含量,丙二醛（MDA）含量和叶片相对电导率的变化。无论是野生型还是转基因烟草的APX活性都是先升高后降低,但转基因植株APX活性显著高于对照。同时逆境胁迫导致转基因和野生型植株叶片中的H2O2含量、MDA含量和叶片相对电导率明显增加,但在相同处理时间上,转基因植株的以上测定值均低于野生型,但转基因烟草的APX酶活性和清除H2O2的能力显著高于野生型,其膜脂过氧化程度较轻。结果表明LetAPX基因的过量表达有助于提高烟草的抗氧化能力。4.测定了低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理等胁迫条件下的种子发芽率,结果表明转基因烟草种子发芽率明显高于野生型,可见转LetAPX基因烟草种子具有一定的耐逆性。转基因植株及野生型植株在逆境胁迫和非胁迫（对照）条件下种植,胁迫条件下野生型植株的总体生长受抑更明显,且逆境处理降低了植株的鲜重和干重,野生型植株的鲜重、干重和生长情况明显低于转基因植株。5.与对照（正常条件）相比,低温、高温、盐胁迫、干旱、H2O2处理后,转基因和野生烟草叶片的光合速率均下降,但野生型植株下降更明显。同时,逆境胁迫下PSII的光化学效率Fv/Fm持续下降,转基因和野生型植株变化趋势相同,但转基因植株光化学效率比野生型要高。这些结果表明烟草中过量表达LetAPX在逆境条件下对光系统有保护作用,转基因烟草具有更高的耐逆性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 活性氧产生的途径及其清除活性氧的系统
• 1.1.1 活性氧产生的途径
• 1.1.2 叶绿体内活性氧产生的途径
• 1.1.3 活性氧的作用及其氧化损伤
• 1.1.4 清除活性氧的酶促与非酶促系统
• 1.1.5 有关抗氧化酶系统的基因工程
• 1.2 APX 研究进展
• 1.2.1 APX 的结构特点及系统分布
• 1.2.2 APX 的分子功能
• 1.2.3 叶绿体APX 的抗氧化功能
• 1.3 本研究目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及处理
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 分子生物学实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取（TRIZOL 试剂盒法）
• 2.2.2 反转录cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 目的基因全长cDNA 的分离
• 2.2.4 叶绿体tAPX 基因正义表达载体的构建
• 2.2.5 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.6 转基因烟草的验证
• 2.2.7 Northern 杂交分析（参考Sambrook 等，1989）
• 2.3 生理生化指标的测定
• 2.3.1 测定种子发芽率
• 2.3.2 测定植株的鲜重、干重
• 2.3.3 光合速率的测定
• 2.3.4 荧光参数的测定
• 2.3.5 活性氧清除酶活性测定
• 2.3.6 活性氧含量测定及AsA 含量测定
• 2.3.7 膜脂伤害程度测定
• 3 结果与分析
• 3.1 LetAPX 基因的分离及其特征
• 3.1.1 APX 基因全长的克隆
• 3.1.2 LetAPX 基因序列分析
• 3.2 基因表达特性分析
• 3.2.1 LetAPX 在番茄不同器官中的表达量不同
• 3.2.2 低温诱导LetAPX 的表达
• 3.2.3 高温诱导LetAPX 的表达
• 3.2.4 盐胁迫诱导LetAPX 的表达
• 3.2.5 干旱胁迫诱导LetAPX 的表达
• 3.2.6 氧化胁迫诱导LetAPX 的表达
• 3.3 转基因株系的获得及检测
• 3.3.1 正义表达载体pBI-LetAPX 的构建
• 3.3.2 克隆载体的PCR 检测
• 3.3.3 表达载体的PCR 检测
• 3.3.4 番茄LetAPX 基因转化烟草及转基因植株的分子检测
• 3.3.5 番茄LetAPX 基因在烟草中的表达
• 3.4 转 LetAPX 基因烟草的表型特征
• 3.4.1 逆境胁迫下 LetAPX 基因的过量表达提高了烟草种子发芽率
• 3.4.2 逆境胁迫下转基因种苗具有更强的生长势
• 3.4.3 盐胁迫下转基因烟草维持较大的鲜重和干重
• 3.5 逆境胁迫下转基因烟草生理生化指标的变化
• 3.5.1 逆境胁迫下转基因烟草光合速率和叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1.1 低温胁迫下转基因烟草光合速率和叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1.2 高温胁迫下转基因烟草光合速率和叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1.3 盐胁迫下转基因烟草光合速率和叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1.4 干旱胁迫下转基因烟草叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.1.5 氧化剂胁迫下转基因烟草叶绿素荧光参数的变化
• 3.5.2 逆境胁迫下转基因烟草 APX 和 CAT 活性的变化
• 3.5.3 逆境胁迫下转基因烟草活性氧含量及膜伤害程度的变化
• 4 讨论
• 4.1 逆境胁迫与植物活性氧代谢及APX 的作用
• 4.2 tAPX 与植物的活性氧清除
• 4.3 tAPX 的氨基酸序列分析
• 4.4 tAPX 与植物抗逆性表达分析
• 4.5 tAPX 与植物的生长发育
• 4.6 tAPX 与植物的光破坏防御机制
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录1 转基因愈伤及小苗
• 附录2 盐胁迫下的植株生长情况
• 附录3 常用缓冲液及培养基的配制
• 致谢
• 攻读学位期间已发表和待发表的论文