论文摘要
布鲁氏菌是一种革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌,由其引发的布鲁氏菌病是一种在世界范围内广泛存在并传播的、以流产和发热为特征的人畜共患传染病。该病对人、畜危害极大,近年呈现出回升的势头。“检、杀、免”是当前防控、消灭动物布鲁氏菌病的主要手段。我国自主研制的羊型M5-90疫苗因其免疫效果好,可有效预防绵羊和山羊布鲁氏菌病。但是该疫苗毒力较强,可造成部分怀孕母畜流产,同时无法区分疫苗免疫和自然感染,从而限制了其在实际中的应用。因此研制一种毒力较弱、具有较好免疫原性,并能进行鉴别诊断的新型疫苗势在必行。本研究以羊种布鲁氏菌M5-90疫苗株为模板,克隆编码bp26部分功能区域序列EP261, EP262的上下游侧翼序列,采用融合PCR方法将上下游臂融合,连接T载体测序后,双酶切并与自杀载体pGEM-7Zf连接;将克隆的枯草芽孢杆菌SacB基因连接至pGEM-7Zf-bp261、pGEM-7Zf-bp262,然后将构建好的同源重组质粒电转化至布鲁氏菌感受态细胞中,通过同源重组的方法获得基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262；对获得的基因突变株进行PCR鉴定和稳定性检测；用布鲁氏菌M5-90疫苗株、M5-90△bp261和M5-90△bp262突变株分别免疫SPF级BALB/c小鼠,通过虎红平板凝集试验和试管凝集试验初步验证小鼠体内的抗体水平,采用间接ELISA的方法测定小鼠体内总IgG水平以及细胞因予IFN-γ的水平；流式细胞术检测小鼠CD4+和CD8+T细胞的含量；采用脾脏指数法确定基因突变株与亲本株之间的毒力差异；攻毒试验检测各菌株的保扩力；PCR扩增bp26基因中55-152段（BP261）及22-185段（BP262）氨基酸区域,将测序正确的基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a上,再转化到大肠杆菌DE3（BL21）中诱导表达,以纯化的BP261,BP262蛋白作为抗原,与突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262免疫小鼠的血清进行Western Blot分析。本研究主要获得如下结果：1.成功获得基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262,在15代内未发生回复突变,革兰氏染色显示突变株生理特征末发生改变,具有良好的遗传稳定性。2.免疫原性研究结果显示两基因突变株均可诱导机体产生与亲本株接近甚至略高于亲本株的抗体水平,同时可诱导机体产生特异性的细胞免疫应答。3.毒力试验结果表明两基因突变株毒力均减弱,M5-90Δbp262的毒力下降显著。4.攻毒试验结果显示突变株M5-90Δbp261、M5-90Δbp262在保护机体抵御16M感染方面的能力与亲本株M5-90相当。5.纯化得到可以高效表达的BP261和BP262蛋白。6. Western Blot分析显示表达的BP261和BP262在与免疫小鼠血清进行反应时,与M5-90免疫的阳性血清出现了条带,而与突变株免疫小鼠血.清均未出现条带,因此可作为突变株配套使用的检测蛋白,用御布鲁氏菌M5-90基因缺失株与布鲁氏菌病自然感染的鉴别诊断。以上结果表明构建的布鲁氏菌基因突变株M5-90△bp261和M5-90△bp262具有良好的疫苗应用前景,同时也为建立用于鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。