烟碱降解菌的分离鉴定、降解特性及其降解途径的初步研究

论文摘要

烟碱俗称尼古丁,是烟草中的主要生物碱,过量吸入烟碱则会抑制中枢系统,麻痹心脏,甚至有生命危险;同时烟草加工过程中产生了含高浓度烟碱的废弃物,严重污染了环境;而且我国烟草上部烟叶烟碱含量普遍偏高,不能用于烟组配方造成了资源浪费和经济损失,因此有效地控制烟草和环境中的烟碱含量,对于维护人类健康和环境有着深远的意义。在工业上利用微生物及其酶来降解烟草中的烟碱,比起传统的物理化学法,不仅可以产生更少有害副产品,而且可以改进烟气品质,提高烟叶资源利用率,有重大的经济效益。本研究以烟碱为唯一碳源,从湖北襄樊烟草种植基地的土壤根际土和烟叶废弃物中分离得到29株具有烟碱降解能力的菌株,降解率都在70%以上,其中19株烟碱降解率能达到90%以上。其中12株烟碱降解菌经常规的形态观察、生理生化分析和16S rDNA序列同源性分析,这12株烟碱降解菌分别属于节杆菌属、假单胞菌属、苍白杆菌属和根癌农杆菌属。通过一系列实验,初步确定根癌农杆菌BKCER11菌株在烟碱浓度0.5g/L-5g/L内生长良好,培养基烟碱浓度大于5g/L时,BKCER11菌株生长受到严重抑制,也不能降解烟碱;该菌在温度20℃-37℃范围内可以生长良好并能降解烟碱,其最适生长温度为30℃;在pH5.5-8.0范围内BKCER11菌株可以生长良好并能降解烟碱,其最适pH为5.5-6.0;经过正交优化,BKCER11菌株烟碱降解的最适条件为:烟碱初始浓度为2g/L、温度为30℃、初始pH为5.5-6.0、以蛋白胨和牛肉膏各0.5%作为复合氮源、微量元素的浓度为5mL/L,降解率能达到96.63%。利用GC-MS初步分析了根癌农杆菌BKCER11菌株降解烟碱的中间代谢产物,检测到有3-（2,3,4-三氢-5-吡咯基）-吡啶和可替宁两种新物质的积累。这与已知的微生物代谢烟碱的三种途径中所涉及到的物质均不一样。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 烟碱的理化性质
• 1.2 烟碱对人体的危害
• 1.3 烟碱在卷烟加工中存在的问题和对环境的污染
• 1.3.1 卷烟加工中上部烟叶的积累
• 1.3.2 烟碱造成的环境污染
• 1.4 微生物降解烟碱的研究进展
• 1.4.1 降解烟碱的微生物种类
• 1.4.2 微生物降解烟碱途径的研究进展
• 1.4.3 微生物降解烟碱的分子生物学研究进展
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 降解烟碱微生物的分离与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟碱降解菌的筛选
• 2.2.1.1 富集培养
• 2.2.1.2 分离纯化
• 2.2.2 烟碱的定量检测
• 2.2.2.1 标准曲线的制作
• 2.2.2.2 烟碱含量的测定
• 2.2.3 烟碱降解菌的鉴定
• 2.2.3.1 生理生化鉴定
• 2.2.3.2 16S rDNA 序列的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 烟碱紫外吸收的标准曲线
• 2.3.2 烟碱降解菌的筛选
• 2.3.3 烟碱降解菌的菌种鉴定
• 2.3.3.1 菌落形态以及液体发酵培养特征
• 2.3.3.2 生理生化特征
• 2.3.3.3 16S rDNA 的全序列分析
• 2.4 小结
• 第3章 根癌农杆菌BKCER11 菌株降解烟碱特性及其发酵条件的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器和设备
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 烟碱的定量检测
• 3.2.2 不同培养时间BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.2.3 不同烟碱浓度BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.2.4 不同培养温度BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.2.5 不同培养基pH BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.2.6 不同氮源BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.2.7 不同微量元素浓度BKCER11 菌株生长量和降解率的测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 根癌农杆菌BKCER11 菌株的生长量和烟碱降解率的关系
• 3.3.2 烟碱浓度对BKCER11 菌株生长和降解率的影响
• 3.3.3 培养温度对BKCER11 菌株生长和降解率的影响
• 3.3.4 培养基初始pH 对BKCER11 菌株生长和降解率的影响
• 3.3.5 氮源对BKCER11 菌株生长和降解率的影响
• 3.3.6 微量元素对BKCER11 菌株生长和降解率的影响
• 3.3.7 培养基各组分添加量的正交优化结果
• 3.4 小结
• 第4章 根癌农杆菌BKCER11 菌株降烟碱代谢机制的初步研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器和设备
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 不同培养时期BKCER11 菌株发酵液的紫外扫描检测方法
• 4.2.2 不同培养时期BKCER11 菌株发酵液的HPLC 检测方法
• 4.2.3 烟碱降解中间产物的GC-MS 检测方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 不同培养时期BKCER11 菌株发酵液中物质的变化
• 4.3.1.1 不同培养时期BKCER11 菌株发酵液的紫外扫描分析
• 4.3.1.2 不同培养时期BKCER11 菌株发酵液HPLC 分析
• 4.3.2 烟碱降解中间产物的GC-MS 分析
• 4.4 小结
• 第5章 总结
• 1、降解烟碱微生物的分离与鉴定
• 2、根癌农杆菌 BKCER11 菌株烟碱降解特性的研究和发酵条件的优化
• 3、根癌农杆菌 BKCER11 菌株降解烟碱代谢机制的初步研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录