小儿轮状病毒感染免疫应答的研究

论文摘要

目的A组轮状病毒是引起小儿脱水性腹泻的主要病原体，对轮状病毒感染免疫应答的认识并不完全，是导致疫苗研究进展缓慢的重要原因之一。本课题通过对轮状病毒腹泻小儿特异性体液免疫应答和Th1／Th2细胞免疫应答的研究，深入认识小儿感染轮状病毒后特异性免疫应答的特点；通过对病原体识别受体一TLR的研究探讨轮状病毒感染后天然免疫应答的特点，为建立轮状病毒感染有效预防和治疗的方法提供理论依据。方法1．收集诊断为轮状病毒腹泻患儿（75例）急性期的血和大便标本，记录其疾病过程中的临床表现，收集近期无腹泻和其他感染性疾病的小儿标本45例作为对照组。2．采用ELISA方法检测轮状病毒抗原，采用逆转录PCR方法确定轮状病毒基因型。3．建立间接ELISA方法检测血浆和大便的轮状病毒特异性抗体。4．以流式细胞仪方法进行淋巴细胞亚群的检测，采用荧光定量PCR方法进行外周血单个核细胞细胞因子mRNA表达的检测。5．采用荧光定量PCR的方法观测轮状病毒感染患儿外周血单个核细胞5种TLR mRNA表达的变化。6．通过HT-29细胞株体外培养和用轮状病毒、柯萨奇B3病毒及福氏志贺氏痢疾杆菌进行感染的方法，采用荧光定量PCR研究TLR mRNA表达在轮状病毒感染中的特征性变化。结果一、急性轮状病毒感染患儿特异性免疫应答的主要特点：1.75例轮状病毒G分型以G3为主，占77.3％，P分型以P[8]为主，占82.7％，其余型别包括G1、G2、P[4]、P[9]。2．血浆中轮状病毒特异性IgM／IgG／IgA抗体滴度均明显高于对照组，粪便中IgA抗体滴度的增高尤为显著，不仅高于对照组而且高于血浆。此外，病情重的患儿血浆和粪便中的IgA抗体更高。3．患儿CD19+细胞百分比（30.8+7.9％）显著高于对照组（23.1+7.7％）。而CD4+细胞的比例明显下降。起病3d以内患儿IFN-γmRNA的表达水平有2倍的升高，IL-12p40 mRNA的表达水平在疾病全程均比对照组明显升高。二、急性轮状病毒感染患儿天然免疫应答中TLR的变化1．起病在3d以内的患儿外周血白细胞中TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 mRNA的表达水平均有明显的升高，3d之后，仅TLR3和TLR8继续升高；而菌痢患儿在起病3d以内和3d以后均表现为TLR2、TLR4 mRNA的明显升高。2．TLR诱导的细胞因子表达水平在轮状病毒感染和菌痢患儿有显著差异。3．体外培养研究结果显示不同滴度轮状病毒感染HT-29细胞后TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 mRNA的表达水平均比对照组明显增加；而柯萨奇B3病毒感染后以TLR2、TLR7和TLR8 mRNA的明显升高为特征；两种病毒引起TLR和细胞因子升高的时间效应和剂量依赖性不同。福氏志贺氏菌攻击HT-29细胞后3hr时有TLR2和IL-8 mRNA表达的明显增加。结论1．急性轮状病毒感染小儿早期出现的免疫应答中，以特异性体液免疫，尤其是粘膜免疫的显著增强为主要特点；细胞免疫应答以Th1反应为早期特征。2．轮状病毒感染至少可诱导5种TLR表达升高，并促使效应细胞因子IFN-γ显著增加，提示TLR在轮状病毒的初始抗感染免疫中发挥重要作用。3．轮状病毒腹泻和菌痢病人外周血单个核细胞TLR表达有明显差异，不同病毒、细菌体外感染细胞后TLR的表达谱有明显不同，显示了不同病原体通过不同的TLR启动宿主的免疫应答；TLR通过促使不同细胞因子的产生，启动并参与感染性腹泻患儿的免疫应答调节。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 急性轮状病毒感染患儿特异性免疫应答的研究
• 前言
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 轮状病毒感染患儿天然免疫应答中 TLR的研究
• 前言
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述1 轮状病毒的免疫保护机制及预防
• 综述2 Toll样受体在机体抗病毒免疫反应中的作用
• 附录:研究生在读期间发表的论著
• 致谢