应激性PKC在心肌肥厚向心力衰竭转化中的作用

论文摘要

蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）是一种多功能的丝氨酸苏氨酸激酶,不仅在细胞的跨膜信号转导中起重要作用,而且在心肌肥厚过程中是主要介导分子,在心肌代偿性肥厚转向心力衰竭的过程中扮演双重角色[1]。长期慢性压力超负荷（如原发性高血压）导致心肌发生代偿性肥厚,可致使心肌收缩性能增强,而室壁应力降低。但如不采取适当干预措施,致使压力超负荷的病理性刺激因素长期存在,过度心肌肥厚将导致心功能由代偿阶段向失代偿阶段转化,最终导致心力衰竭。此转化过程中,究竟何种PKC起主导作用,或是哪几种PKC亚型相互协作共同调节这一过程,PKC各亚型间关系如何,以及它们在心肌肥大转向心衰中的作用机制如何是我们关注的焦点。本实验室通过分离成年大鼠心肌细胞,获取了成年大鼠心肌细胞在不同电刺激频率下收缩的正常指标,并对心肌细胞分别进行PKC激动剂和抑制剂灌流,发现PKC激动剂能引起负性肌力改变,而PKC抑制剂则能使心肌细胞收缩性能增强[4]。本实验室的既往研究从细胞层次和微观角度观察了PKC和心肌细胞收缩功能之间的关系,其机制有待进一步探究。我们将大鼠心肌在应激条件下反应性表达增多的PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ称之为应激性PKC[5]。本文采取离体工作心脏、单个心肌细胞分离、在体大鼠颈动脉血压测量、Western Blot和免疫荧光组化、细胞转染以及活体大鼠siRNA转染等多角度多层次的方法,对1w、8w、16w和20w腹主动脉缩窄（transverse abdominal aortic constriction,TAC）导致高血压大鼠的心脏功能进行检测,主要结果如下:1. TAC大鼠心肌不同程度肥厚和心功能降低,长期压力超负荷持续作用促使心肌肥厚向心力衰竭转化。对实验组和同步对照组进行离体工作心脏灌流,在固定负荷（前负荷10 mmHg,后负荷60 mmHg）下,1w和8w TAC组大鼠心输出量（cardiac output,CO）和固有心率（intrinsic heart rate, IHR）与其对照组相比无明显差异;用100 nM PKC非特异激活剂PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate,佛波酯）作用10 min之后,TAC组大鼠CO和IHR略低于对照组,可见激活PKC可抑制心脏功能。16w TAC大鼠心脏CO和IHR都较同步对照组有显著增加,且CO增加幅度比IHR更大,使每搏输出量（SV,srtroke volum）代偿性增加,可见16wTAC大鼠心脏功能处于代偿性功能增强阶段;100 nM PMA作用之后,TAC组大鼠由代偿转向心衰。20w TAC大鼠心功能在高血压因素持续作用下已由代偿期转向失代偿,CO较对照组明显减少,IHR却显著加快,因此每搏输出量（stroke volume,SV）急剧减少;100 nM PMA作用之后,TAC大鼠的心衰更加显著。TAC大鼠左心室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP）高于同期对照组,心室内压力最大舒张速度（maximal rate of left ventricular pressurerelaxation,- dP/dtmax）较对照组明显减慢,说明TAC大鼠心脏的舒张功能受到严重损伤,随着心衰程度的加深,心室舒张越加迟缓。灌流结束后称量心脏重量,发现心室质量/体重比随TAC时间延长逐渐增高。2.长期压力超负荷作用下TAC大鼠心肌收缩和舒张功能受损,高心率条件下舒张功能受损更严重。离体工作心脏灌流后发现,20w TAC大鼠左心室LVEDP高于同期对照组, - dP/dtmax较对照组明显减慢,说明TAC大鼠心脏的舒张功能受到损伤,随着心衰程度的加深,心室舒张越加迟缓。由前述结果可知,16w大鼠心脏处于代偿性功能增强阶段,而20w大鼠心脏已转向心衰。因而依次给16w TAC大鼠离体工作心脏300 beats/min, 360 beats/min和420 beats/min的电刺激,同时联合以100 nM PMA灌流10 min,CO随着电刺激频率的增加先轻微增加后显著减少。在其他组别的实验动物中没有发现此现象。推测原因可能是16w TAC大鼠心脏在360 beats/min电刺激下出现一个轻微的频率依赖性舒张功能增强性CO增加,即在适度频率增加的情况下,心脏舒张功能增强,回心血量增加。但在PMA广泛激活肥厚心肌中过表达的PKC的情况下,更高频率刺激（如本实验中420 beats/min的电刺激）使心动周期缩短更甚,由于心脏舒张时间占整个心动周期的3/4,所以高频刺激下肥厚心脏的舒张不全更加严重,使CO急剧减少。3. TAC大鼠心肌细胞PKCα向膜结构转位增强,提示在高血压大鼠心肌肥厚和由心肌肥厚转向心衰过程中,PKCα可能起重要作用。文献报道在心肌肥厚过程中,PKC起重要作用。用免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜对分离出16w和20w大鼠单个心肌细胞进行染色和观察,结果显示:16w、20w TAC大鼠心肌细胞PKCα向膜结构转位增强,且在20w TAC较在16w TAC更加明显。用PMA孵育心肌细胞后,发现心肌细胞中PKCα转位较同组不孵育时明显。对心肌细胞进行其他PKC亚型的免疫组化染色,未发现明显的改变。PKC向细胞膜结构转位可视作激活的标志,未经激活的PKC位于心肌细胞的胞浆中,一旦PKC被激活,就会向膜结构转位。在心肌肥厚向心力衰竭转化的过程中,PKCα激活显著增强,这一结果提示在TAC大鼠心脏由肥厚转向心衰的过程中,PKCα可能起了重要作用。4. TAC大鼠心肌各PKC亚型蛋白与钙转运相关蛋白表达的改变。Western Blot结果显示,1w和8w大鼠心肌匀浆各PKC亚型和兴奋-收缩偶联相关蛋白表达未有明显改变。而16w和20w大鼠心肌匀浆PKCα表达较同期对照组明显增加。PKCβⅠ和PKCε表达也较同期对照有所增加,但这两种亚型转位激活并未见明显改变。筛查心肌细胞兴奋-收缩偶联关键蛋白,发现L-型Ca2+通道蛋白表达在各组别未见明显改变。TAC组大鼠心肌细胞匀浆受磷蛋白PLB磷酸化总水平较各自对照组略有降低,且20w较16w降低更明显。PLB-17位磷酸化水平无明显改变,而TAC组PLB-Ser16位磷酸化水平较同期对照组降低。而受PLB磷酸化水平调节的心肌SERCA2α蛋白表达变化如下:16w TAC大鼠心肌SERCA2α表达较对照组增加,而20w TAC大鼠心肌SERCA2α表达较对照组减少。由此推测:TAC大鼠心脏在长期压力超负荷条件下,通过一系列调节,导致心肌PKCα过表达或激活,使心脏收缩和舒张功能受损,特别是心脏舒张功能。舒张功能在代偿性高心率下受损更加严重。高血压因素持续存在,最终导致心力衰竭。有研究报道心肌PKCα过度表达的转基因小鼠中,心肌细胞中的PKCα过度表达或激活能磷酸化I-1蛋白,从而抑制PLB-16位丝氨酸磷酸化,影响心肌细胞SERCA2α活性,导致ATP酶活性降低,肌质网钙泵和Ca2+亲和力降低以及肌质网钙摄取功能障碍,从而影响了心肌舒张功能,致使CO下降。这可能是PKC调节心脏舒缩功能的机制之一。本文试图从活体大鼠PKCα-siRNA转染出发,进一步完善实验。初步结果如下:1)使用in vivo-jet PEI活体转染试剂和带有绿色荧光基团的siRNA试剂混合,注入大鼠股静脉。摸索最佳转染时间,并在激光共聚焦显微镜下观察分离出的该大鼠单个心肌细胞,发现该种转染试剂确实可将基因序列转入心肌细胞中,并排除了心肌自发荧光对观测的影响。2) HEK293细胞能恒定表达PKCα,且易于转染。本实验培养肾源性HEK293细胞,并用Lipofectamine 2000作为载体将目的siRNA转入细胞中。筛选沉默效率最高的PKCα-siRNA序列。确定最佳转染时间和最佳转染浓度。3)大鼠活体siRNA转染成功后用离体工作心脏、Western Blot来检验特异性沉默PKCα的效果。综上所述,大鼠心脏在长期压力超负荷作用下,导致心肌细胞中PKCα过度表达或激活,通过一些中间环节作用传递间接降低PLB-16位丝氨酸磷酸化水平,影响SERCA2α的活性,导致肌质网钙摄取功能障碍,心肌细胞胞浆中的钙离子水平在心肌收缩后不能迅速降低,影响了心肌舒张功能,在高心率下尤甚。在心肌肥厚向心衰过转化过程中,应激性PKC特别是PKCα起了重要作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• PKC 的分子结构
• 心脏 PKC 蛋白酶的表达情况
• PKC 在心肌细胞中的定位
• PKC 调节心脏功能的分子基础
• 已激活的心肌PKC的目标作用底物
• PKC信号转导通路
• PKC在心肌肥厚向心力衰竭转化过程中的作用
• 调节和影响心肌细胞收缩力的因素
• 实验一 TAC 大鼠心功能动态变化
• 1 引言
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 TAC 大鼠心肌 PKCs 与兴奋-收缩偶联关键蛋白的变化
• 1 引言
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 在体 siRNA 转染下调 PKCα 对 TAC 大鼠心功能影响的探索
• 1 引言
• 2 实验方法
• 总结与展望
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢