四株海洋放线菌遗传转化体系的研究

论文摘要

作者所在的课题组,自1998年以来从胶州湾海泥中陆续分离了800株海洋放线菌,并从4株放线菌中分离出了12个新结构活性化合物。选择产生新颖抗肿瘤抗生素的海洋放线菌M045和M048,产全霉素的海洋放线菌M095和产蒽醌类化合物的海洋放线菌M097为研究材料,建立了海洋放线菌的遗传转化体系,为海洋放线菌的遗传工程操作及天然化合物组合生物合成奠定了基础。（1）通过接合转移建立了菌株M045的遗传转化体系。用来源于蓝藻Anacystis nidulans UTEX625的别藻蓝蛋白基因验证了转化体系的有效性。通过PCR及基因组步移方法获得长度为1709bp的部分聚酮合成酶（PKS）基因,分析其同放射菌素基因具有同源性,利用基因中断插入失活该基因,但未获得突变株。因此尝试通过反向遗传学方法,克隆该菌株中新骨架抗肿瘤抗生素——中国霉素的生物合成基因簇,本研究已经构建了该菌株Fosmid基因组文库,对基因组文库的筛选工作正在进行中。（2）利用PEG-介导的质粒pIJ702转化原生质体和接合转移两种方法均成功获得菌株M048的转化子,其中接合转移率高达10-4。菌株M048来源于高盐的海洋环境,维持原生质体所需渗透压与模式菌株—变铅青链霉菌（Streptomyceslividans）有很大差异,本研究对菌株M048原生质体形成和再生的各种因素进行了优化,获得了渗透压稳定剂蔗糖最佳浓度为0.4M。质粒pIJ8600整合于菌株M048染色体上,对该转化株的抑菌活性、薄层层析（TLC）以及HPLC-MS进行了分析。结果表明,同野生菌株相比,该转化株对7种受试菌的抑菌活性显著增强,TLC显示差异的化合物条带,HPLC-MS显示化合物组分有差异。因此质粒pIJ8600的整合,引起菌株次级代谢产物生物合成途径的改变,使有抑菌活性的化合物大量累积。从菌株M048染色体上克隆获得了1196bp的部分PKS基因,通过基因中断插入失活该基因,结果显示M048突变株次级代谢产物抑菌活性增强,HPLC分析发现显著差异。初步分析该PKS基因的中断使菌株体内某些生物合成途径受阻,而大量合成抗菌活性强的chandrananimycin C,或者产生了抑菌活性强的其它化合

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 海洋放线菌概述
• 1.1.1 海洋放线菌的多样性
• 1.1.2 海洋放线菌次级代谢产物
• 1.1.2.1 抗生素
• 1.1.2.2 抗肿瘤化合物
• 1.1.2.3 抗菌活性物质
• 1.1.2.4 作用于遗传物质的化合物
• 1.1.2.5 酶抑制剂
• 1.1.2.6 其他活性化合物
• 1.1.3 海洋放线菌中结构新颖的次级代谢产物
• 1.2 聚酮类化合物的生物合成机制及组合生物合成
• 1.2.1 聚酮类化合物的生物合成机制
• 1.2.1.1 I 型PKS 基因
• 1.2.1.2 II 型PKS 基因
• 1.2.1.3 III 型PKS 基因
• 1.2.2 聚酮类化合物的组合生物合成
• 1.2.2.1 I 型PKS 的组合生物合成
• 1.2.2.2 II 型PKS 的组合生物合成
• 1.2.2.3 非核糖体多肽合成酶（NRPSs）的组合生物合成
• 1.2.3 组合生物合成技术在聚酮类化合物合成中的应用
• 1.2.3.1 将聚酮生物合成途径引入新的宿主
• 1.2.3.2 提高聚酮化合物的产量
• 1.2.3.3 合成新的抗生素
• 1.2.4 组合生物合成在海洋放线菌中应用前景的展望
• 1.3 放线菌遗传转化方法
• 1.3.1 转化
• 1.3.1.1 PEG-介导的质粒转化原生质体
• 1.3.1.2 电穿孔
• 1.3.2 接合转移
• 1.3.3 转导
• 1.4 本研究的意义及主要内容
• 第二章 PEG-介导原生质体转化及接合转移方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 缓冲液
• 1.1.5 Southern 杂交所用试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 四株海洋放线菌敏感性
• 1.2.1.1 四株海洋放线菌对不同抗生素的敏感性
• 1.2.1.2 敏感抗生素最佳作用浓度的筛选
• 1.2.1.3 海洋放线菌固体培养时敏感抗生素最佳作用浓度的筛选
• 1.2.2 PEG 介导原生质体的转化
• 1.2.2.1 原生质体的制备
• 1.2.2.2 菌丝体培养基
• 1.2.2.3 P 缓冲液中蔗糖浓度对原生质体形成及再生的影响
• 1.2.2.4 甘氨酸浓度对菌丝体生长、原生质体形成及再生的影响
• 1.2.2.5 溶菌酶浓度对原生质体形成及再生的影响
• 1.2.2.6 原生质体的再生
• 1.2.2.7 放线菌质粒的转化
• 1.2.2.8 放线菌质粒DNA 的提取
• 1.2.2.9 大肠杆菌质粒的分离
• 1.2.2.10 大肠杆菌Top10 感受态细胞的制备
• 1.2.2.11 质粒DNA 的大肠杆菌转化
• 1.2.2.12 限制性内切酶酶切反应
• 1.2.2.13 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA
• 1.2.2.14 DNA 连接反应
• 1.2.2.15 DNA 的保存
• 1.2.3 大肠杆菌——海洋放线菌属间接合转移系统的建立
• 1.2.3.1 海洋放线菌单孢子悬液的制备
• 1.2.3.2 接合转移
• 1.2.3.3 接合转化子的检测
• 1.2.3.4 放线菌总基因组DNA 的提取
• 1.2.3.5 Southern 杂交检测
• 1.2.4 四株海洋放线菌菌株基因组上attB 位点的克隆以及多序列比对
• 1.2.4.1 attB 位点的PCR 引物
• 1.2.4.2 PCR 反应体系
• 1.2.4.3 PCR 反应程序
• 1.2.4.4 PCR 产物的T 载体克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 四株海洋放线菌敏感性
• 2.1.1 海洋放线菌对不同抗生素的敏感性
• 2.1.2 敏感抗生素最佳作用浓度的筛选
• 2.2 PEG 介导原生质体转化条件的优化
• 2.2.1 影响原生质体形成因素的探讨
• 2.2.1.1 菌丝体的培养基筛选
• 2.2.1.2 P 缓冲液中蔗糖浓度对原生质体形成及再生的影响
• 2.2.1.3 甘氨酸浓度对菌丝体生长、原生质体形成及再生的影响
• 2.2.1.4 溶菌酶浓度对原生质体形成及再生的影响
• 2.2.2 原生质体再生条件的选择
• 2.2.3 PEG 介导原生质体的遗传转化
• 2.3 大肠杆菌——海洋放线菌接合转移
• 2.3.1 接合转移条件的优化
• 2.3.1.1 培养基的选择
• 2.3.1.2 四株海洋放线菌孢子预萌发时间的摸索
• 2.3.1.3 供体和受体比例的确定
• 2.3.2 大肠杆菌与四株海洋放线菌菌株的属间接合转移
• 2.3.2.1 穿梭质粒pPM801、pPM803 以及温敏型质粒pHZ132 向海洋放线菌的转移
• 2.3.2.2 整合型质粒pIJ8600 向海洋放线菌的转移
• 2.3.3 接合转化子的酶切验证
• 2.4 菌株M048 整合质粒pIJ8600 后接合转化子的Southern 杂交检测
• 2.5 四株海洋放线菌基因组上整合位点（attB）位点的克隆和比对
• 2.5.1 四株海洋放线菌染色体上attB 位点的克隆
• 2.5.2 四株海洋放线菌attB 序列的测序和比对
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 四株海洋放线菌遗传转化体系的验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 常用缓冲液配制
• 1.1.4.1 柱层析缓冲液
• 1.1.4.2 SDS-PAGE 相关溶液
• 1.1.4.3 免疫印迹（Western-blot）分析相关溶液
• 1.1.4.4 重组别藻蓝蛋白抗氧化活性检测相关溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒pAPIJ 的构建
• 1.2.2 用接合转移法将质粒pAPIJ 转入四株海洋放线菌菌株中
• 1.2.3 接合转化子的基因组提取、PCR 验证及基因组酶切Southern 杂交验证
• 1.2.4 重组别藻蓝蛋白（rAPC）的表达
• 1.2.4.1 蛋白粗提物的制备及SDS-PAGE 分析
• 1.2.4.2 Western-blot 分析
• 1.2.5 金属离子螯合亲和层析
• 1.2.5.1 色谱行为
• 1.2.5.2 柱料的再生
• 1.2.6 纯化的rAPC 抗氧化活性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒pAPIJ 的构建
• 2.2 四株海洋放线菌转化株基因组的PCR 及Southern 杂交验证
• 2.3 别藻蓝蛋白表达的SDS-PAGE 检测
• 2.4 别藻蓝蛋白表达的Western blot 检测
• 2.5 重组别藻蓝蛋白在菌株M097 中的纯化
• 2.6 重组别藻蓝蛋白（rAPC）抗氧化活性检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 三株海洋放线菌整合质粒pIJ8600 的生物活性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 受试菌株
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 三株菌株的发酵培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 抑菌活性的检测
• 1.2.1.1 菌株的发酵
• 1.2.1.2 代谢产物的提取
• 1.2.1.3 检测样品的制备
• 1.2.1.4 受试菌株的培养
• 1.2.1.5 生物活性检测
• 1.2.2 薄层层析检测（TLC）
• 1.2.3 粗提物生物活性跟踪
• 1.2.4 高相液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析
• -） 的构建'>1.2.5 质粒pIJ8601（pIJ8600-tipA^-） 的构建
• 1.2.6 用接合转移法将质粒pIJ8601 转入菌株M048
• 1.2.7 M048/pIJ8601 转化株抑菌活性
• 1.3 质粒pIJ8600 在菌株M048 染色体上拷贝数的验证
• 1.3.1 随机引物法标记探针
• 1.3.2 Southern 杂交
• 1.4 M048/pIJ8600 转化株化合物的分离及结构解析
• 2 结果与分析
• 2.1 抑菌活性筛选
• 2.1.1 抑菌活性试验
• 2.1.2 薄层层析（TLC）检测
• 2.1.3 海洋放线菌菌株M048 转化质粒pIJ8601 后抑菌活性的变化
• 2.1.4 活性示踪
• 2.1.5 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）结果
• 2.2 质粒pIJ8600 在菌株M048 染色体上拷贝数
• 2.3 海洋放线菌菌株M048 转化株次级代谢产物分离以及结构解析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 三株海洋放线菌PKS 基因功能的初步验证
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 质粒
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因组步移
• 1.2.1.1 主要试剂
• 1.2.1.2 Universal GenomeWalker 工作原理
• 1.2.2 三株海洋放线菌部分聚酮合酶（PKS）基因的克隆
• 1.2.2.1 菌株M045 部分PKS 基因的克隆
• 1.2.2.2 菌株M048 部分PKS 基因的克隆
• 1.2.2.3 菌株M095 部分PKS 基因的克隆
• 1.2.3 基因中断试验
• 1.2.4 基因中断菌株的发酵和生物活性检测
• 1.2.5 基因中断菌株发酵产物的高效液相色谱（HPLC）分析
• 2 结果与分析
• 2.1 三株海洋放线菌菌株聚酮合成酶基因的克隆
• 2.1.1 菌株M045 部分PKS 基因的克隆
• 2.1.2 菌株M048 部分PKS 基因的克隆
• 2.1.3 菌株M095 部分PKS 基因克隆
• 2.2 接合转移以及活性菌株检测
• 2.2.1 接合转移
• 2.2.2 抑菌活性试验
• 2.2.3 高效液相色谱分析基因中断转化株化合物的变化
• 2.2.3.1 菌株M048 基因中断转化株的HPLC 检测
• 2.2.3.2 菌株M095 基因中断转化株的HPLC 检测
• 3 讨论
• 4 小结
• 第六章 海洋放线菌菌株M045 基因组文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 载体
• 1.2 方法
• 1.2.1 Fosmid 文库的构建
• 1.2.2 Fosmid 文库插入片段大小的验证
• 1.2.3 Fosmid 基因组文库的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株M045 基因组的提取及纯化
• 2.2 随机打断M045 基因组
• 2.3 脉冲场电泳
• 2.4 补平的DNA 的回收
• 2.5 插入片段大小的验证
• 2.6 Fosmid 文库的筛选
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表文章
• 致谢