论文摘要
【背景与目的】酪氨酸激酶受体（RTK）是一类具有特殊结构的穿膜蛋白。目前，已经有20种RTK家族被发现。RTK的异常激活能在很多病理情况下被检测到，比如EGFR家族的高表达和异常激活是乳腺癌和肺癌病程进展的重要标志。因此，RTK可被作为一个肿瘤治疗干预的靶向位点。像目前应用于临床的赫赛汀就是一种EGFR2（Her2）的单克隆抗体，它已经在乳腺癌和肺癌的治疗中体现出了非常显著的效果。RON受体酪氨酸激酶（recepteur d’origine nantais，RON）属于MET原癌基因家族。自从于1993年被发现后，对其生物化学以及生物学特性的研究已经取得了重要的进展。研究发现RON在胚胎发育、肿瘤恶性表型形成以及炎症机制中起着重要的作用。本实验通过以转染RON的NIH 3T3细胞为抗原制备抗RON的单克隆抗体，鉴定该抗体的特性，研究它对结肠癌RKO细胞系在5-氟尿嘧啶（5-Fu）化疗耐药方面的影响，并试图探讨其中的相关机制。【实验方法】1．用重组质粒pDR2-wt-RON、pcDNA3.1-RON△160分别转染小鼠胚成纤维细胞NIH 3T3和结肠癌细胞RKO，克隆化培养出wt-RON NIH 3T3、wt-RON RKO、RON△160 RKO细胞株。2．以wt-RON NIH 3T3为细胞抗原免疫BALB／C小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后用HAT培养液选择培养杂交瘤细胞。3．用改良的间接免疫法筛选出具有能分泌抗wt-RON NIH 3T3而不抗NIH 3T3的杂交瘤细胞株。4．有限稀释法单克隆化培养杂交瘤细胞株，并再次用改良间接免疫荧光法筛选细胞株。5．用筛选出的产单克隆抗体杂交瘤细胞株注射到小鼠腹腔以制备腹水瘤，通过收集腹水取得单克隆抗体粗品，并以正辛酸—硫酸氨法提纯。6．用制备的5种抗体以改良的间接免疫荧光法分别检测NIH 3T3、wt-RON NIH 3T3、RKO、wt-RON RKO、RON△160 RKO、293、HT-29、DLD1、Lovo、MCF7等10个细胞株RON的表达。7．用MTT比色法检测wt-RON RKO、RON△160 RKO细胞株对化疗药物5-Fu的耐药性影响。8．用MTT比色法检测单抗对wt-RON、RON△160 RKO细胞株的生长以及5-Fu耐药方面的作用。【结果】1．制备出18株产抗体杂交瘤细胞株，其中15株能够稳定分泌抗体。2．5株抗体对10个细胞系的特异性结合情况各有不同，但基本能够反应其对表达RON、和RON变异体细胞的特异性结合能力。3．相比RKO、wt-RON RKO细胞，RON△160 RKO细胞对5-Fu具有更强的化疗耐药性。MSP在对5-Fu的耐药性形成方面未表现出明显作用。4．5株抗体对wt-RON RKO、RON△160 RKO细胞株无明显的中和活性，其中4株反而可增加细胞对5-Fu的耐药性。、【结论】1．制备出具能分泌RON特异性单克隆抗体的15个细胞株。2．RON和RON变异体的表达可产生抗凋亡作用使RKO细胞产生对5-Fu的耐药性。3．制备出的RON抗体无中和RON活性，其中4个抗体反而可能激活RON的活性。