多巴胺代谢系统儿茶酚氧位甲基转移酶、多巴胺转运体基因多态性与卒中后抑郁的相关性分析

论文摘要

研究背景：脑卒中除引起多种神经功能障碍外,还常导致一系列情感行为的变化,抑郁是脑卒中后最常见和最重要的神经精神并发症,对患者的认知、神经功能恢复和生活质量均有不利影响。卒中后抑郁（Post-stroke depression, PSD）是指在有明显临床症状的卒中发作后出现的以情绪低落、兴趣下降为特征的脑卒中后常见的并发症。其发病率临床报道不一,国内文献报道PSD发生率为31.2%～63.1%,国外报道为25%～79%,从大量的临床报道可见PSD的发生率集中在40%～50%左右。随着生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转换,卒中后抑郁及抗抑郁治疗备受关注。PSD的发病机制目前尚不明确,普遍认为是由社会心理学、神经解剖学和神经生物学等多方面因素介导的,其中神经生物学因素一直是近几年研究的热点。PSD的原发内源性学说认为它是脑的特定区域损伤并伴随有神经递质改变的结果,具体而言,大脑额叶、边缘系统、丘脑及脑干蓝斑核等损伤能使人类产生抑郁情绪,而这些神经结构间的沟通主要是通过各种神经递质传递来完成。去甲肾上腺素（Norepinephrine, NE）和5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine,5-HT）是神经系统的重要递质,其神经元胞体位于脑干,轴突通过丘脑下部、基底神经节区,环绕胼胝体和放射冠,然后由前向后通过深层皮质,并逐渐发出分支,末端终止于表层,形成额叶/颞叶-基底节-脑干腹侧环路,该环路负责调控情绪、睡眠和认知等。脑卒中破坏该环路可引起与神经心理活动有关的各种神经递质的合成、代谢和传导障碍,导致5-HT、NE等神经递质合成减少,或引起突触后膜的受体数目和/或敏感性改变都会导致抑郁。多巴胺（Dopamine, DA）也参与精神和情绪活动,它包含的中脑-大脑皮质、中脑-边缘叶系统亦与人类的精神和情绪活动关系密切。对于原发性抑郁症的病理生理机制研究提示：抑郁症的发生与脑内单胺类神经递质功能活性的低下有关,尤其是5-HT及NE,二者与抑郁症的关系已经得到可被广泛认可的结论,但由于不少新型抗抑郁药物对DA的代谢有明显作用,使研究者们觉得DA在抑郁的生化机制中起着重要作用。早在1975年Randrup等首先提出,多巴胺可能参与抑郁症的发病。也有Schwaninger等认为,抑郁症病人不仅仅是5-HT、NE能神经传导异常,DA能神经传导异常也涉及抑郁症的病理生理学机制。最近Maj等发现,使用激动剂、而非抑制剂阿扑吗啡抗抑郁治疗后有可能增加活性状态的D2、D3受体的密度,DA受体反应下降的患者,使用帕罗西汀抗抑郁治疗效果会更好。这提示也许SSRIS是通过增加DA受体敏感性起作用,表明了多巴胺在原发性抑郁中起到了非常重要的作用。近年来另有吕路线等研究表明,PSD患者血浆、脑脊液中的DA浓度低于卒中无抑郁组甚至正常对照组；炎彬等研究了脑缺血再灌注小鼠海马、纹状体、皮层的单胺类神经递质及其代谢物的变化规律,认为PSD的发生与海马脑缺血再灌注损伤后NE、DA系统异常有着密切联系,PSD患者用增加单胺类递质含量的抗抑郁药物治疗后,抑郁症状可以缓解,进一步支持以上理论。这就提示了我们脑卒中后所导致的多巴胺代谢系统功能紊乱在PSD的发生中也可能具有重要地位。DA在脑内作为神经递质影响运动、行为、情感和垂体激素的释放,有些能影响DA代谢的药物具有抗抑郁作用,如安非他酮,它是相对选择性DA回收抑制剂,对DA受体也有激动作用,双盲对照研究表明,这种第二代抗抑郁药的效果优于安慰剂,并等同于阿米替林。因此,最近有人提出DA代谢系统功能异常可能与抑郁发病关联的两种学说：一种认为抑郁患者可能存在DAD1受体功能低下；另一种认为抑郁患者存在中脑边缘系统DA功能失调,由中脑腹侧被盖区及伏隔核等构成的中脑边缘DA通路在奖赏过程中起关键作用,最近人们逐渐认识到,该奖赏通路在调节动力、睡眠、食欲、昼夜节律及人对愉悦或厌恶刺激的反应中起重要作用,几乎所有的长期抗抑郁治疗都会增加DA诱导的奖赏反应。儿茶酚氧位甲基转移酶（Catechol-O-methyhl transferase, COMT）是广泛存在于人体内的一种代谢酶,主要通过甲基化直接而选择性地降解前额皮质突触内60%以上的DA,是具有生物活性或毒性的儿茶酚胺的主要代谢酶,也是最关键酶。COMT基因定位于22q11.2,是一个变异较多的基因。现阶段研究最多的是其第4外显子上的一个G→A的点突变,使得其编码的108位或158位氨基酸由Val突变为Met,导致酶活性有3～4倍的改变,因而会导致不同基因型个体体内神经递质含量出现明显的不同。Val/Val基因型的COMT具有高活性,Val/Met基因型的酶具有中度活性,Met/Met基因型的酶具有低活性,这是由高活性等位基因G和低活性等位基因A两种等位基因决定的,以共显性方式遗传。Massat等研究发现,高活性COMT Val等位基因,尤其是Val/Val基因型与早发抑郁有关,并指出COMT基因可能在神经精神疾病的易感性及症状学中发挥复杂和多效的作用。PSD的神经递质学说认为,急性脑卒中后抑郁状态的发生与血清中单胺类神经递质的功能活性降低有关,研究证明PSD患者存在DA功能低下,推测DA功能低下可能是由于DA生成减少或降解增加,即有效前体酪氨酸减少或与合成、代谢有关的酶的机制改变,或是胺传递功能减弱所致。而高活性的该酶可使作为底物的多巴胺等神经递质降解及消除加快,从而缩短其作用时间,降低DA作用效率,可增加对抑郁患者的认知功能损害的风险,因而该突变点引发COMT酶活性的变化在人群中是否会造成相关性状的生物学改变,是否与PSD的发病相关联,都是非常值得深入研究的遗传学课题。多巴胺转运体（Dopamine transporter gene, DAT）是位于DA能神经元突触前膜的跨膜蛋白,它特异地再摄取突触间隙的DA,终止DA能信号传递,是维持DA能神经功能稳定的最重要的因子,尤其对脑功能的正常维持非常重要。它限制了多巴胺能受体激活的时间、程度、范围,调节DA浓度,而多巴胺的多少又与许多神经疾病有关。若转运蛋白的摄取功能异常,将导致突触间隙递质浓度的升高或降低,从而引起相应递质系统功能活性的改变,很多治疗神经疾病的药物将转运蛋白作为其直接作用的靶点,通过调节转运蛋白的功能,调整神经递质在突触间的时程,从而改变神经系统信号通路,达到治疗的效果。人类DAT基因定位于5p15.3,目前其3’UTR 40bp VNTR研究最多。该VNTR多态性位于非编码区,它本身不可能直接改变DAT的结构和功能,但研究发现其与脑内DAT的表达和利用率有关。DAT该多态性位点不沉默,而且影响该基因产生高水平mRNA的表达,研究表明10次重复等位基因较其他等位基因对于DAT基因的表达具有更强的增强作用,10/10基因型个体比9/10基因型个体的纹状体内DAT蛋白含量增加20%左右。而另外两项研究则认为9次重复等位基因编码的DAT具有更高的表达和利用率。高活性的DAT可以增加突触前膜DA的再摄取量,使突触间隙DA减少、效率下降。Brunswick等发现抑郁症患者基底神经节多巴胺转运蛋白的亲合力可能比正常对照组更高,提示抑郁症患者的多巴胺功能是可以变化的,也许这正是抗抑郁药物可能有效的原因。动物实验研究已经证实了所有类型的抗抑郁药物都可以引起多巴胺转运蛋白亲合力的变化。Joyce PR等认为DAT-9倍重复等位基因是抑郁患者边缘型人格障碍的危险因素,在老年抑郁患者中相关性尤为明显。脑卒中破坏了DA信号传递通路又可反馈引起DAT功能活动及亲和力的变化,推测其在PSD的发生中也可能发挥一定的作用。目的：探讨DA递质代谢相关蛋白COMT Val108/158Met、DAT40 bp VNTR两位点基因多态性与PSD的关系。研究方法及分组：以珠江医院神经内科住院病人为研究人群,患者根据第四次全国脑血管学术会议做出卒中诊断和汉密尔顿抑郁量表做出抑郁诊断,按入组条件选择入组病人159例,分为单纯脑卒中组91例（男59例,女32例）和卒中后抑郁组68例（男40例,女28例）。运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析技术,采集被试者全血2mL, EDTA抗凝后采用苯酚-氯仿抽提法提取外周血白细胞和基因组]DNA。PCR引物（上游5’-ACT GTG GCT ACT CAG CTG TG-3’,下游为：5’-CCT TTT TCC AGG TCT GAC AA-3’）扩增COMT基因,NlaⅢ内切酶检测COMT基因Val108/158Met多态性。同时利用PCR引物（上游5’-TGT GGT GTA GGG AAC GGC CTG AG-3’,下游：5’-CTT CCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG-3’）扩增DAT基因,比较各扩增片段大小。运用SPSS13.0统计软件包,采用卡方检验比较单纯脑卒中组与卒中后抑郁组各等位基因、基因型频率分布的差异,当理论频数<5时,则改为Fisher精确概率法。结果：（1）COMT Val108/158Met多态性分析：卒中后抑郁组等位基因A频率（21.3%）低于单纯脑卒中组（33.5%）,等位基因G频率（78.7%）高于单纯脑卒中组（66.5%）,两组之间总体比较差异有统计学意义（χ2=5.703,P＝0.017, OR=1.860, 95%CI=1.114～3.107）。但按性别比较,等位基因G和A频率在两组男性之间的比较差异无统计学意义（χ2=1.864,P=0.172）,而在两组女性间的比较则差异有统计学意义（χ2=4.610, P=0.032, OR=2.455,95%CI=1.069～5.635）。卒中后抑郁组野生型G/G占多数（63.2%）,突变型A/A仅占（5.9%）,单纯脑卒中组杂合型A/G则占多数（47.3%）,突变型A/A占（9.9%）,两组3种基因型A/A、A/G、G/G总体比较差异有统计学意义（χ2=6.489,P=0.039）,但按性别比较,在两组男性中比较差异无统计学意义（χ2=1.701,P=0.476）,在两组女性中比较则差异有统计学意义（χ2=6.547,P=0.024）。（2）DAT 40 bp VNTR多态性分析：DAT基因40 bp VNTR以10倍（480bp）重复片段为主,卒中后抑郁组与单纯脑卒中组分别占91.9%和90.7%,其次为9倍（440bp）重复片段,两组中分别占5.9%、5.5%。两组之间等位基因、基因型频率及杂合度比较差异均无统计学意义（χ2=1.966,P=0.634；χ2=2.248,P=1.000；χ2=0.125,P=0.724）。将DAT基因型和等位基因分为10/10倍重复基因型、非10/10倍重复基因型、10倍重复等位基因和非10倍重复等位基因比较,两组10倍重复基因型与非10倍重复基因型比较差异无统计学意义（χ2=0.145,P=0.703）；两组10倍重复等位基因与非10倍重复等位基因比较差异无统计学意义（χ2=0.152,P=0.697）。结论：1、本研究组中COMT Val108/158Met基因多态性与PSD的发生可能有相关性,这种相关性主要体现在女性患者,表明该基因多态性可能在女性卒中后抑郁的遗传发病机制中起更大作用。2、DAT 40bp VNTR基因多态性与PSD遗传易感性可能无关,需进一步研究验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 1.1 研究对象
• 1.2 研究工具
• 1.3 样本采集
• 1.4 实验试剂和仪器
• 1.5 实验方法
• 1.6 统计学处理
• 实验结果
• 2.1 一般临床特征比较
• 2.2 COMT基因各基因型与等位基因频率的比较
• 2.3 DAT基因各基因型与等位基因频率的比较
• 讨论
• 3.1 COMT基因多态性与卒中后抑郁的研究
• 3.2 DAT基因多态性与卒中后抑郁的研究
• 3.3 本研究的局限性及将来的研究方向
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 中英文名词对照与缩写
• 致谢
• 统计学审稿证明