木聚糖酶产生菌的筛选、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选

论文摘要

木聚糖酶可以水解木聚糖为低聚木糖和D-木糖,它在饲料、纸浆造纸、食品、纺织等方面有着广阔的应用前景。本文综述了木聚糖酶的性质、研究进展及应用等,研究了木聚糖酶产生菌的筛选鉴定、产酶条件优化、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选,以丰富木聚糖酶的产酶菌种,提高产量,为其工业应用提供依据。本研究采用透明圈法从云南腾冲温泉出水口土壤样品中筛选并纯化得到了12株木聚糖酶的产生菌。再通过摇瓶发酵,用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法对每株菌的酶活力进行了测定,其中菌株Xylan-12的酶活最大,达到68.67IU/ml。通过16Sr DNA序列相似性分析鉴定菌株.Xylan-12为Bacillus FLVothermus。为提高酶活力进行了一系列培养基及培养条件的优化实验,确定菌株Bacillus flavothermus产木聚糖酶的最适碳源是半纤维素+麸皮的复合碳源,最适氮源是（NH4）2SO4,最佳产酶时间是发酵72h,培养基最佳初始pH为7.0。最佳培养基为（g/L）:半纤维素6,麸皮4,（NH4）2SO4 0.5,K2HPO4 1.0,MgSO4·7H2O 0.3, CaCL2·2H2O 0.2,K2SO4 0.1,NaCl0.2,Tween-80.01%,pH7.0。经优化Xylan-12的酶活力提高了21.4%。对Bacillus fravothermus产木聚糖酶的酶学性质进行了研究,改变木聚糖酶作用时的温度和pH值,确定该酶的最适值及其耐受性。研究表明,Bacillus fothermus产木聚糖酶的最适反应温度是65℃,最适反应pH是6.O;该酶的热稳定性非常好,在80℃保温时,残余酶活力也有近70%.,这种在高温稳定的特性利于工业生产的应用:该酶在pH7.0时酸碱稳定性最好,其pH稳定性范围较宽。为克隆温泉土样中的木聚糖酶基因,通过提取未培养腾冲温泉土壤样品的基因组DNA,剪切并末端平头化后,用pucl8质粒为载体构建了一个包括1.2×105左右克隆的宏基因组文库,文库中外源DNA总容量约为3.O×105kb,文库中插入所需大小片段的成功率达87%。文库的筛选和保存工作现在正在进行中,到目前筛选和保存了文库的克隆数为0.4×105,其中筛选到了2个菌落周围有水解圈的克隆。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 木聚糖概述
• 1.2 木聚糖酶研究进展
• 1.2.1 木聚糖酶的分类
• 1.2.2 木聚糖酶的性质
• 1.2.3 木聚糖酶的分子结构
• 1.2.4 木聚糖酶产生菌的筛选和菌种鉴定
• 1.2.5 木聚糖酶的诱导和发酵
• 1.2.6 木聚糖酶的基因工程
• 1.2.7 木聚糖酶的应用
• 1.3 研究的背景及目的意义
• 1.3.1 木聚糖酶研究的热点及存在的问题
• 1.3.2 研究的目的意义
• 第二章 木聚糖酶产生菌的分离筛选及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶与生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半纤维素的制备
• 2.2.2 木聚糖酶产生菌的富集培养
• 2.2.3 木聚糖酶产生菌的分离与纯化
• 2.2.4 革兰氏染色
• 2.2.5 透明圈检查
• 2.2.6 酶活的测定
• 2.2.7 16SrRNA 基因序列分析法鉴定菌种
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 半纤维素的制备
• 2.3.2 木聚糖酶产生菌的分离与纯化
• 2.3.3 革兰氏染色
• 2.3.4 透明圈检查
• 2.3.5 酶活的测定
• 2.3.6 16SrRNA 基因序列分析法鉴定菌种
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 小结
• 2.4.2 讨论
• 第三章 BACILLUS FLAVOTHERMUS 产酶条件优化及酶学性质研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 Bacillus flavothermus 产酶条件优化
• 3.2.2 Bacillus flavothermus 产酶的酶学性质研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Bacillus flavothermus 产酶条件优化
• 3.3.2 Bacillus flavothermus 产酶的酶学性质研究
• 3.4 小结与讨论
• 3.4.1 小结
• 3.4.2 讨论
• 第四章 温泉菌宏基因组文库的构建与筛选
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 样品来源
• 4.1.2 酶与生化试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 未培养温泉菌基因组DNA 的提取
• 4.2.2 pUC18 载体制备
• 4.2.3 建库流程
• 4.2.4 文库的筛选和保存
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 未培养温泉菌基因组DNA 的提取
• 4.3.2 总DNA 的Shear 剪切
• 4.3.3 温泉菌宏基因组文库快速鉴定结果
• 4.3.4 文库的筛选和保存
• 4.4 小结与讨论
• 4.4.1 小结
• 4.4.2 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录