新疆维吾尔族食管鳞癌蛋白质图谱研究

论文摘要

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌高发国家,鳞癌约占我国食管癌总数的80%。食管癌流行病学特征除了显著的地域分布差异之外,民族分布差异亦是其主要的特征之一。食管癌的发生在新疆有着显著的地域性和民族聚集性,提示新疆食管癌的发生受环境和遗传因素共同影响。维吾尔族是新疆的主体民族,但是已有的研究对新疆维吾尔族食管癌的相关研究较少。目前仍然缺乏食管癌的早期诊断方法,大部分食管癌患者确诊时已属中晚期,治疗的效果欠佳。手术治疗是食管癌治疗的主要方法,食管癌患者手术后死亡的主要原因是肿瘤复发和转移,肿瘤淋巴结转移是影响食管癌预后的重要因素之一。目前对手术前有无淋巴结转移判断存在不准确的问题,给手术和治疗方式选择带来了一定的盲目性。提高患者手术前TNM分期的准确率,特别是提高对淋巴结转移判断的准确性,对于提高食管癌患者的治疗水准和改善预后具有重要意义。目前还没有找到可以有效应用于食管癌术后复发和转移早期检测的血清标志物。如何提高食管癌早期诊断率、手术前淋巴结转移诊断准确性和有效监测治疗后复发及转移,尤其是寻找方便有效的血清诊断标志物,已经成为目前临床和基础研究的重要要方向。蛋白质是生命活动的具体执行者和体现者,肿瘤的发展过程中往往有蛋白质的动态变化。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质,提供一组蛋白质的功能及其模式的信息,能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果。因此,可以在蛋白质组的水平进行进一步探索,寻找用于肿瘤的术前诊断、分期和术后随访监测等方面特异、灵敏的标志物。利用差异蛋白质组学的研究方法对肿瘤和正常人群的差异表达蛋白进行定量、定性、表征分析并且筛选出肿瘤相关的蛋白标记物已成为目前研究的热点。随着蛋白质组学相关技术的迅速发展,临床血清蛋白质组学成为当今生命科学领域中极其活跃的学科,临床血清蛋白质组学从新的角度研究肿瘤,寻找肿瘤标志物,为肿瘤的早期诊断、预后和动态监测提供了重要依据。表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS或SELDI）技术是一种将生物样品（如细胞液或体液）中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上,用激光脉冲辐射使芯片上的蛋白质解析形成荷电离子,这些不同质荷比（M/Z）的离子在真空电场中飞行的时间长短不同,据此绘制出质谱图,以获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息。将正常人样本的图谱信息同某种疾病患者比较,就有望发现新的疾病相关蛋白质。SELDI-TOF-MS质谱技术已在许多肿瘤标志物研究中应用并取得成功。应用蛋白质组学SELDI-TOF-MS技术对新疆不同民族血清蛋白质指纹图谱的检测结果提示汉族、哈萨克族、维吾尔族食管癌患者间的血清蛋白质指纹图谱存在着明显的差异。本研究采用SELDI-TOF-MS技术对新疆维吾尔族的血清蛋白质指纹图谱进行检测,结合临床以及病理学资料探讨血清目标蛋白质在新疆维吾尔族食管癌患者诊断和术前淋巴结转移判断当中的价值。分析SELDI-TOF-MS技术对食管癌患者手术治疗前后血清蛋白质表达差异检测结果,探讨可能的临床意义。目的：本研究的目的是通过SELDI-TOF-MS质谱技术分析食管癌鳞癌患者和无癌健康者血清蛋白表达谱的改变以及手术前后的血清蛋白表达谱变化,筛选并建立维吾尔族食管鳞癌诊断和患者淋巴结转移诊断的血清标志物模型。寻找食管癌手术前后变化的血清标志物,进一步完善食管癌诊断、淋巴结转移及预后判断意义的食管癌蛋白表达谱系。这将有助于更深层次的理解食管癌基因学、蛋白组学改变以及加深对肿瘤发生机制的认识,为食管癌疾病早期诊断和和检测术后复发提供血清学的依据。本课题主要进行了三个方面的研究：1)新疆地区维吾尔族食管鳞癌患者与健康者血清差异表达蛋白的研究；2)新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移血清蛋白质指纹图谱研究；3)食管癌手术前后血清蛋白质组学变化研究。方法：采用弱阳离子交换蛋白芯片（CM10）和表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI）技术检测血清样本,应用ZUCI-Protein Chip Data Analyze System软件包分析所得到的数据。用支持向量机方法建立蛋白质指纹图诊断模型,用留—法交叉验证作为评估模型判别效果的方法。两组之间的蛋白质峰的比较采用Wilconxon秩和检验,P<0.05有统计学意义。1)检测分析了43例维吾尔族食管鳞癌患者和22例性别、年龄匹配的正常对照血清蛋白表达谱,建立新疆维吾尔族食管鳞癌诊断模型；2)检测分析了21例维吾尔族食管鳞癌有淋巴结转移、22例维吾尔族食管鳞癌无淋巴结转移的患者和22例维吾尔族正常对照的血清,筛选维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移的血清标记物,建立维吾尔族食管癌淋巴结转移诊断模型。3)检测分析45例食管鳞癌患者的手术前和手术后血清蛋白表达谱,筛选手术前后发生变化的蛋白质标志物。结果：1)维吾尔族食管鳞癌组与正常对照血清蛋白M/Z峰值图谱明显不同。所得到差异性最大的10个蛋白中（P<0.05）,有5个峰在食管癌组呈高表达,M/Z为4487.3973、11693.8038、9160.7745、5494.4509、15963.7368。5个峰呈低表达,M/Z为2763.4477、6648.88、8712.8596、6681.2584、8789.2461。建立了由7个蛋白（M/Z分别为：4487.3973、8712.8596、9160.7745、5494.4509、6681.25843、8789.2461、11693.8038）组成的诊断模型。采用十倍交叉留一法验证,该诊断模型的敏感度为86.05%（37/43）,特异度为68.18%（15/22）；2)新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者组,淋巴结阴性组和健康人血清的蛋白M/Z峰值图谱明显不同。筛选了6个蛋白质峰（M/Z4487.7591、5494.0576、7992.6041、5874.1964、5899.7251、8584.908）建立了维吾尔族食管癌淋巴结阴性患者诊断模型。用十倍交叉留一法验证,其敏感度为81.82%（18/22）,特异度为86.36%（19/22）；建立了由6个蛋白质峰（M/Z 4487.6122、2763.5209、8713.1525、5494.5497、11693.2483、2750.9962）组成的维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者诊断模型。用十倍交叉留一法验证,其敏感度为80.95%（17/21）,特异度为86.36%（19/22）；建立了由3个蛋白质峰（M/Z 3275.3129、9442.91、2046.0471）组成的维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移诊断模型。用十倍交叉留一法验证,模型的敏感度为76.19%,特异度为77.27%；3)食管癌患者手术前后血清蛋白质指纹图谱存在明显差异,表达差异最大的10个蛋白质峰（P<0.05）中M/Z 8712.3909、8788.9114、6450.9811、8585.3391、6649.156、6899.7862手术后表达低于手术前,M/Z 11496.6914、16153.17、7993.1528、11418.0658手术后表达高于手术前。其中3个蛋白质峰（M/Z 8712.3909/8714.1856、8788.9114/8789.6786、6649.156/6649.9783）与此前筛选到的维吾尔族食管鳞癌患者与正常对照之间差异蛋白质峰相同。结论：1)表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术和生物信息学分析软件的联合应用是一种寻找食管癌鳞癌生物标志物的有效方法,构成的诊断模型可以准确灵敏的区分维吾尔族食管鳞癌和健康人；2)维吾尔族食管鳞癌淋巴结阳性患者,淋巴结阴性患者和健康对照组血清蛋白质指纹图谱明显不同。其中5个蛋白峰（M/Z为16081.0634、16152.0842、15962.2598、2019.8519、2044.3842）可能对判定病情预后有重要意义；3)新疆维吾尔族食管癌手术前后血清蛋白质组学变化研究筛选到的3个蛋白质峰（M/Z 8712.3909/8714.1856、8788.9114/8789.6786、6649.156/6649.9783）可能并非是肿瘤分泌的特异性标记物,有可能是与肿瘤患者体内原有的受到抑制免疫相关蛋白或因为进食困难较正常已经降低的营养状况相关指标,其分子特征有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 新疆维吾尔族食管鳞癌血清SELDI蛋白质图谱诊断模型的建立
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 质量控制
• 1.4 生物信息学处理
• 1.5 差异蛋白质峰的数据库查询
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第二部分 新疆维吾尔族食管鳞癌淋巴结转移的血清蛋白质图谱分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 质量控制
• 1.4 生物信息学处理
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 第三部分 食管癌患者手术前后血清SELDI蛋白质指纹图谱变化的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 质量控制
• 1.4 生物信息学处理
• 1.5 差异蛋白质峰的数据库查询
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 附
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 个人简历
• 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表