贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物区系的研究

论文摘要

贡嘎蝠蛾（Hepialus gonggaensis）幼虫是名贵中药材冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的优势寄主之一。在冬虫夏草人工培植中蝠蛾幼虫的饲养是基础。但目前人工养殖蝠蛾幼虫中幼虫抗逆力弱,易受微生物感染,是影响冬虫夏草资源保护和开发的重要制约因子。研究贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群多样性,对于研究其营养生理,进而改善和研制蝠蛾人工饲料,提高幼虫抗逆力和成活率有重要意义。本研究以四川康定雅家埂山上采集的贡嘎蝠蛾为实验材料,利用传统分离纯化技术与分子生物学方法研究了贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物多样性。用传统的分离纯化,以及生理生化鉴定的结果显示,贡嘎蝠蛾幼虫肠道中共分离出12种不同的细菌,经鉴定分属于8个属。贡嘎蝠蛾幼虫肠道中还存在3种不同的真菌,分别是隐球酵母（Cryptococcus magnus）、Geomyces sp和丝孢酵母（Trichosporon porosum）3个类群的真菌。首先,采用基于16S rRNA基因的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism ）法,通过保守序列设计引物对贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌基因组DNA进行PCR扩增。对扩增得到的16S rRNA序列连接到PMD18-T载体中,将连接产物转化到大肠杆菌JM109中,建立16S rRNA克隆文库。用限制性内切酶EocRI、MspI和HaeⅢ对16S rRNA克隆文库中的204个阳性克隆的质粒进行酶切分析,结果显示有有35个不同的RFLP操作分类单元（OTU）。其次,采用基于ITS（internal transcribed spacer）基因的RFLP方法,以贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的总DNA为模板,用真菌ITS区通用引物进行PCR扩增。建立贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的ITS克隆文库,分别用MspI、HaeⅢ和TaqI对205个阳性克隆的质粒酶切指纹图谱分析,结果显示有23个不同的RFLP操作分类单元。因为每种图谱很可能就代表一个不同的微生物种群,所以通过分析RFLP图谱,即可相应反映出该环境中微生物种类的数量及群落中的优势菌群。把RFLP分析得到的35种有差异的16S rRNA酶切图谱以及23种有差异的ITS酶切图谱的克隆进行测序。并对所得序列以分子信息技术进行BLAST比对,结果表明:共有11个不同属的细菌存在于贡嘎蝠蛾幼虫肠道中,其中有15个操作单元都代表Rahnella sp,9个操作单元都代表Carnobacterium sp,这两种菌属分别占总16S rRNA克隆文库的45.58%和30.88%;共有8个不同属的真菌存在于贡嘎蝠蛾幼虫肠道中,其中被孢霉属（Mortierella）和丝孢酵母属（Trichosporon）的丰度最高,分别占克隆文库的46.34 %和40.00 %,鉴定为肠道内的优势真菌类群。结果显示,贡嘎蝠蛾幼虫肠道中存在着大量的细菌和真菌,它们的种类和数量各不相同,即贡嘎蝠蛾幼虫肠道中具有丰富的微生物多样性。此方法对贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物进行研究将是可行的。在RFLP法与纯培养的比较研究中,两种方法检测到的微生物多样性结果不完全一致,说明每种方法都有一定的选择性和局限性,得到纯培养的物种并不一定是肠道环境中的真正的优势类群,它们或许只占环境中细菌总数的一小部分。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.1.1 问题的提出
• 1.1.2 研究的意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 贡嘎蝠蛾的研究现状
• 1.2.2 昆虫肠道微生物的研究进展
• 1.3 本文研究的目的和研究内容
• 1.3.1 本文研究的目的
• 1.3.2 本文研究的主要内容与技术路线
• 2 肠道微生物研究方法介绍
• 2.1 引言
• 2.2 传统的分类鉴定方法
• 2.3 细菌16S RRNA 序列在微生物多样性分析中的应用
• 2.3.1 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳技术
• 2.3.2 单链构象多态性分析技术
• 2.3.3 随机扩增多态性分析技术
• 2.3.4 限制性片段长度多态性分析技术
• 2.3.5 基因探针杂交技术
• 2.3.6 核酸印迹杂交技术
• 2.3.7 利用16S-235 rRNA 基因区间序列进行的研究
• 2.4 真核生物ITS 区在微生物多样性分析中的应用
• 2.4.1 利用rRNA 上具高度保守性的区域设计通用引物
• 2.4.2 以ITS 区段的RFLP 图谱作为标记特征进行分子鉴定
• 2.4.3 根据DNA 序列进行分子鉴定
• 2.5 小结
• 3 PCR-RFLP 法分析贡嘎蝠蛾幼虫肠道细菌区系
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 研究材料
• 3.2.2 试验仪器
• 3.3 实验方法与步骤
• 3.3.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道总DNA 的提取
• 3.3.2 细菌16S rRNA 基因PCR 扩增
• 3.3.3 PCR 产物的纯化
• 3.3.4 高效感受态细胞的制备
• 3.3.5 16S rRNA 基因文库的构建
• 3.3.6 阳性克隆筛选
• 3.3.7 RFLP 酶切分型和系统进化关系分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道内细菌的总DNA 提取
• 3.4.2 16S rDNA 的PCR 扩增
• 3.4.3 阳性克隆的鉴定
• 3.4.4 EcoRI、MspI 及HaeⅢ的酶切分析结果
• 3.4.5 系统发育分析
• 3.5 小结
• 4 贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌区系分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 贡嘎蝠蛾样品的采集及处理
• 4.2.2 实验材料与试剂
• 4.2.3 引物序列
• 4.2.4 试验仪器
• 4.3 实验方法与步骤
• 4.3.1 肠道微生物总DNA 的提取
• 4.3.2 ITS 片段的PCR 扩增
• 4.3.3 PCR 产物的纯化
• 4.3.4 高效感受态细胞的制备
• 4.3.5 ITS 基因文库的构建
• 4.3.6 阳性克隆筛选
• 4.3.7 RFLP 酶切分型和克隆文库分析
• 4.3.8 贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的分离培养及与非培养法的比较
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道内真菌的总DNA 提取与ITS 序列的PCR 扩增
• 4.4.2 ITS 克隆文库的构建与筛选
• 4.4.3 序列比对与RFLP 分析
• 4.4.4 系统发育分析
• 4.4.5 贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的分离培养法与非培养法的比较
• 4.5 小结
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.1.1 贡嘎蝠蛾幼虫肠道各种微生物数量差异大
• 5.1.2 贡嘎蝠蛾幼虫肠道微生物的种类特殊
• 5.1.3 纯培养和分子生物学方法鉴定结果不一致
• 5.1.4 研究方法的评价
• 5.1.5 PCR-RFLP 分析方法的局限
• 5.2 后续工作与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录:
• B.作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目