论文摘要
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的实体恶性肿瘤之一,手术切除和肝移植仍是目前最有效的治疗手段,但疗效不佳,术后复发和转移是其最主要原因。HCC是富血供肿瘤,血管生成被认为与HCC的侵袭转移密切相关,肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用参与了该过程。Caveolin-1是细胞膜上内陷微区域的主要结构蛋白,在肿瘤侵袭转移和血管生成过程中发挥着重要作用。目前,对caveolin-1在不同肿瘤中的作用尚存在着两种完全不同的观点。Caveolin-1最初被认为是抑癌基因,但最近越来越多的研究发现,caveolin-1过表达参与了肿瘤的侵袭转移和血管生成。在有关HCC的研究中发现,下调caveolin-1能抑制不同淋巴道侵袭能力小鼠HCC的侵袭转移。本研究所前期采用SuperArray基因芯片技术对HCC转移相关基因进行筛选,发现caveolin-1是重要的促转移候选基因之一。这些研究提示,caveolin-1参与了HCC的侵袭转移和血管生成,但其机制有待进一步阐明。已有研究表明,血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是HCC血管生成中最主要的刺激因子,但多数研究caveolin-1与VEGF诱导血管生成之间的关系都集中在内皮细胞上,而对肿瘤细胞上caveolin-1表达是否与VEGF诱导的血管生成有关尚不清楚。基于以上研究背景,本研究采用免疫组织化学和细胞化学、qRT-PCR及Western blot技术检测HCC组织标本和肝癌细胞株中caveolin-1的表达,并分析caveolin-1与HCC临床病理学因素、VEGF及肿瘤血管生成相关指标（肿瘤微血管密度（MVD）、非成对动脉（UA））之间的相关性;利用慢病毒表达系统构建caveolin-1 RNA干扰载体,并借助qRT-PCR、ELISA、侵袭实验和划痕实验分析其对人肝细胞癌株SMMC7721 VEGF表达和侵袭、运动能力的影响;利用MTT法和二维凝胶血管生成体外模型探讨下调SMMC7721细胞中caveolin-1表达的培养上清液对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖和VEGF诱导的血管生成的影响。主要结果和结论如下:第一部分:Caveolin-1在HCC中的表达及临床意义1、26例伴肝内转移的HCC组织标本中,癌组织内caveolin-1 mRNA表达水平高于正常肝组织、肝硬化组织和癌旁组织,差异均具有统计学意义（P=0.046、0.021、0.039）。75例HCC组织标本行免疫组织化学检测显示,量化分析caveolin-1表达强度（P=0.001）、阳性百分比（P=0.002）、计分（P=0.001）均与转移显著相关。Caveolin-1表达强弱与VEGF（r=0.293, P=0.011）、MVD（r=0.361, P=0.001）、UA（r=0.388, P=0.001）均呈显著正相关。生存分析发现,caveolin-1高表达患者预后比低表达者差（P=0.014）。单变量分析发现,肿瘤大小、门静脉癌栓、肝内转移、caveolin-1表达强弱、VEGF表达水平、MVD和UA都是HCC的重要预后因素;但多变量分析（COX回归模型）发现,只有肿瘤大小和VEGF表达水平是其独立预后因素,而caveolin-1表达水平并非其独立预后因素。2、在HepG2和SMMC7721肝癌细胞株中,免疫细胞化学结果显示,Caveolin-1在SMMC7721呈强阳性表达,而在HepG2中未见明显表达;Western blot检测结果与免疫细胞化学结果一致,且发现在SMMC7721中caveolin-1表达与VEGF高表达呈显著正相关（r=0.888,P<0.01）;qRT-PCR检测结果显示,SMMC7721细胞中caveolin-1 mRNA表达水平明显高于HepG2,差异有统计学意义（P<0.01）。侵袭实验分析证实了SMMC7721的侵袭能力高于HepG2（P=0.003）。第二部分:Caveolin-1 RNAi慢病毒载体构建及其对人肝细胞癌株SMMC7721 VEGF表达和侵袭、运动能力的影响1、成功构建慢病毒系统介导的caveolin-1 RNAi载体,其可较长时间、稳定表达于SMMC7721,感染5天后转导效率为（96.0±1.2）%,并能显著敲除靶细胞SMMC7721中目的基因caveolin-1的mRNA（敲除率约90%）和蛋白表达。2、沉默Caveolin-1能显著降低SMMC7721细胞内VEGF mRNA表达水平,相对阴性感染对照组下降水平约50%（P<0.05）;ELISA法检测显示分泌至胞外的VEGF蛋白水平表达约下降20%（P<0.05）。3、Caveolin-1下调能显著抑制SMMC7721的侵袭和运动能力,各个时相点相对对照组差异均有统计学意义（P均小于0.01）;给予外源性重组人VEGF后能显著恢复其侵袭能力（P<0.05）,证实caveolin-1可通过调控VEGF参与HCC的侵袭转移。第三部分:SMMC7721 Caveolin-1沉默培养上清液对HUVEC eNOS表达和内皮细胞增殖、成管的影响1、采用原代培养的HUVEC可较好的保持其纯度和降低变异程度。Caveolin-1 RNAi后SMMC7721培养上清液使HUVEC细胞活力显著下降,增殖能力受到抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。2、Caveolin-1 RNAi后SMMC7721细胞上清液能显著抑制HUVEC管腔结构的形成（P<0.05）,给予外源性重组人VEGF后可恢复HUVEC管腔结构的形成（P<0.05）,CD34标记的免疫组化检测结果证实了该结果。3、SMMC7721细胞caveolin-1沉默后上清液能显著抑制HUVEC细胞上eNOS ser-1177位点的磷酸化（P<0.05）,于24h抑制最为明显,而eNOS总蛋白表达没有发生变化。综上所述,本研究主要结论如下:1、人HCC组织中caveolin-1表达水平升高与肿瘤转移、预后差和肿瘤血管生成显著正相关;高侵袭潜能人肝细胞癌株SMMC7721中caveolin-1表达较高,并与VEGF表达升高呈显著正相关。Caveolin-1可能是预测HCC侵袭转移潜能和预后的指标之一。2、利用慢病毒系统成功构建的caveolin-1 RNAi载体可较长时间、稳定表达于SMMC7721,并能显著下调其caveolin-1的表达;沉默caveolin-1能显著降低SMMC7721细胞内VEGF mRNA表达及其分泌至胞外的VEGF蛋白表达水平;Caveolin-1下调能显著抑制SMMC7721的侵袭和运动能力,给予外源性重组人VEGF后能恢复其侵袭能力,证实caveolin-1可通过调控VEGF参与HCC的侵袭转移。3、人肝细胞癌株SMMC7721中caveolin-1沉默引起的分泌型VEGF表达下调能显著抑制HUVEC的增殖能力;利用基质胶构建的二维凝胶血管生成体外模型发现,caveolin-1沉默的人肝细胞癌株SMMC7721条件培养基能显著抑制HUVEC管腔结构的形成和eNOS的活化,而给予外源性重组人VEGF后则能恢复其管腔结构;这表明肝癌细胞中caveolin-1沉默引起的分泌型VEGF表达下调通过抑制肿瘤血管生成中VEGF介导的eNOS活化而阻遏了HUVEC管腔结构的形成,即肝癌细胞中caveolin-1表达可能通过诱导VEGF介导的肿瘤血管生成,进而促进HCC的侵袭转移,这可能是干预HCC侵袭转移的有效靶点。
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