色谱—质谱联用分析微生物代谢网络

论文摘要

代谢组学作为一种新的组学研究技术,在微生物中已经得到了广泛应用,而其相关应用的拓展与仪器分析技术的发展有着密切关系。目前代谢组学研究中常用到的分析技术包括毛细管电泳-质谱（CE-MS）、核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术。其中气相色谱-质谱与液相色谱-质谱得到了更为普遍的应用。利用代谢组学分析技术研究微生物代谢网络、代谢通量,从而全面理解微生物生理、生化功能,将大大丰富系统生物学的研究内容,成为生命科学研究的一种重要手段。本文以Escherichia coli 1.1566 （E.colil.1566）及其不同的敲除基因型菌株为研究对象,利用GC-MS、LC-MS分析手段,建立微生物代谢组学的分析平台；以小分子代谢物为目标,利用代谢指纹分析进行相关网络分析。首先,通过利用甘氨酸为唯一氮源,利用GC-MS手段,比较E.colil.1566和其敲除琥珀酸脱氢酶基因的突变株（z△sdhAB）的代谢指纹图谱,通过多变量数据处理,发现两株菌细胞内浓度变化较大的8种化合物；并对检测到的胞内主要氨基酸进行相关分析,发现脯氨酸、异亮氨酸和谷氨酰胺之问的关系发生显著变化。其次,通过已建立的GC-MS技术研究比较低温生理盐水淬灭法（N.S.）与冷甲醇淬灭法,发现前者能更有效的防止胞内化合物泄漏,实现代谢物的提取。进而结合该淬灭方法,建立了一种适合微生物代谢指纹分析的LC-MS方法并据此分析发现E. colil.1566及BC101敲除基因型菌株细胞内浓度变化较大的12种代谢物。第三,通过结合代谢分析与基因芯片分析,研究Escherichia col1.1566和其不同的敲除基因型菌株,在以果糖为碳源,全合成培养条件下的菌株的相关代谢网络变化。最后,通过对处于拟稳态的酿酒酵母培养物施加葡萄糖底物脉冲,在不同时间点取样测定细胞内外主要化合物的量。利用上述数据和细胞内糖酵解途径模型进行各反应途径的参数估计；同时,对糖酵解途径进行代谢控制分析,发现磷酸果糖激酶、已糖激酶和已糖转运系统具有较大的通量控制系数。随机改变细胞内外化合物的浓度对细胞能荷状态的模拟显示,酿酒酵母能在1分钟内将细胞的能荷状态恢复到初始水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 微生物代谢组学简介
• 1.1.1 代谢组学
• 1.1.2 微生物代谢组学
• 1.1.3 微生物的代谢物
• 1.1.4 微生物代谢网络数据库
• 1.1.5 代谢通量分析
• 1.2 微生物代谢组学方法研究
• 1.2.1 微生物代谢分析流程
• 1.2.2 微生物样品的培养与保藏
• 1.2.3 微生物样品的预处理
• 1.2.4 微生物代谢组学研究中的分析与检测技术
• 1.2.5 微生物代谢组学的数据处理
• 1.2.5.1 数据预处理
• 1.2.5.2 模式识别
• 1.3 代谢组学在微生物研究中的应用
• 1.3.1 在工业微生物学中的应用
• 1.3.2 在医学微生物学中的应用
• 1.3.3 在环境微生物学中的应用
• 1.4 微生物代谢组学展望
• 1.5 本论文研究的意义和内容
• 第二章 甘氨酸氮源对Escherichia coli代谢网络的影响研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 仪器和试剂
• 2.2.2 试验菌株
• 2.2.3 培养基及培养条件
• 2.2.3.1 培养基
• 2.2.3.2 培养条件
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞干重的测定
• 2.3.2 样品淬灭和提取
• 2.3.3 衍生方法
• 2.3.4 GC-MS分析方法
• 2.3.5 数据处理
• 2.3.6 代谢物的定性
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 两株菌生长状态的比较
• 2.4.2 两株菌代谢差异分析
• 2.4.3 潜在标记物的选择
• 2.5 本章小结
• 第三章 色谱-质谱联用分析微生物代谢网络方法研究
• 前言
• 第一节 GC-MS联用研究代谢物淬灭提取方法
• 3.1.1 前言
• 3.1.2 实验材料
• 3.1.2.1 仪器和试剂
• 3.1.2.2 试验菌株
• 3.1.2.3 培养基及培养条件
• 3.1.3 实验方法
• 3.1.3.1 样品淬灭和提取方法
• 3.1.3.2 衍生方法
• 3.1.3.3 GC-MS分析方法
• 3.1.3.4 标准溶液配制
• 3.1.3.5 数据处理
• 3.1.4 结果和讨论
• 3.1.4.1 GC-MS指纹图谱的比较
• 3.1.4.2 选择性代谢物的分离分析比较
• 3.1.4.3 方法验证
• 3.1.4.4 表型区分
• 3.1.4.5 GC-MS胞内代谢物的定性分析
• 3.1.4.6 小结
• 第二节 LC-MS在微生物代谢分析中的应用
• 3.2.1 前言
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.2.1 仪器和试剂
• 3.2.2.2 菌株和培养条件
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 样品制备
• 3.2.3.2 LC/MS-IT-TOF分析条件
• 3.2.4 结果与讨论
• 3.2.4.1 LC-MS分析得到的图谱
• 3.2.4.2 表型区分
• 3.2.4.3 VIP代谢物的分析
• 3.2.5 本章小结
• 第四章 代谢与基因分析结合研究遗传背景改变对E.coli的影响
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 仪器和试剂
• 4.2.2 实验菌株
• 4.2.3 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 菌株培养
• 4.3.2 GC-MS分析与数据处理
• 4.3.3 实验菌株的基因分析
• 4.3.4 实验菌株子网络活化基因的鉴定
• 4.3.5 实验菌株的鞭毛泳动实验
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 GC-MS分析实验菌株代谢结果
• 4.4.2 E.coli管家基因表达模式
• 4.4.3 与实验菌株鞭毛基因相关的亚网络
• 4.4.4 实验菌株鞭毛泳动实验结果
• 4.5 本章小结
• 第五章 酿酒酵母糖酵解代谢途径的动态模拟
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 模拟流程
• 5.2.2 菌株和培养条件
• 5.2.3 模型和软件
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 参数估计结果
• 5.3.2 代谢控制分析（MCA）结果
• 5.3.3 糖酵解代谢途径的能荷模拟结果
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢