水稻隐性长穗颈（eui）基因表达的基础生物学研究

论文题目: 水稻隐性长穗颈（eui）基因表达的基础生物学研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 肖辉海

导师: 陈良碧

关键词: 温敏雄性核不育水稻,隐性长穗颈,温度,细胞,抑制差减杂交,特异表达

文献来源: 湖南农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 隐性长穗颈(elongated-uppermost-internode，简称eui)性状是解决不育系包颈现象的重要要遗传资源。有关温敏雄性核不育水稻中eui基因的遗传规律等方面已有深入研究，但环境因素对eui基因表达的影响、穗颈节间伸长的细胞学机制、eui基因的特异性cDNA片段的克隆等方面的研究还未见报道。本文以培矮64S为对照，研究温度对隐性长穗颈温敏雄性核不育水稻eui基因表达的影响，eui基因促进穗颈节间伸长的细胞学机制，以及利用SSH技术分离隐性长穗颈温敏雄性核不育水稻长选3S穗颈节间特异表达的cDNA片段。主要研究结果如下：(1)自然条件下长选3S茎秆高度比培矮64S的高24.3cm，主要是由倒一节间(即穗颈节间)的伸长所致，长选3S的倒一节间比培矮64S的长16.6cm，增加的长度占长选3S倒一节间长度的47.3％。倒二节间和倒三节间也有一定的伸长，倒四节间与对照基本一致。穗颈伸出剑叶鞘的长度由倒一节间长度和剑叶鞘长度决定，长选3S剑叶叶鞘与培矮64S相比增长2.8cm，表明隐性长穗颈基因对叶鞘伸长有一定的促进作用，但这种促进作用远小于对穗颈节间伸长的促进作用，使隐性长穗颈不育系长选3S的包颈程度比培矮64S的大大降低或不包颈。(2)长选3S穗颈伸出叶鞘的长度与始花当天的日均温度无关，而与始花前20-9 d自然条件下的日均温度呈负相关，其中以始花前17-12d(花粉母细胞形成至减数分裂期)日均温度负相关性最显著。始花前不同时段24℃处理的结果表明：与对照相比，包穗现象有不同程度的减轻，有5个处理使穗全部伸出剑叶叶鞘，其中以始花前17-12 d(即花粉母细胞形成至减数分裂期)温度处理伸颈伸出长度最大，人工温度处理的结果与自然条件下温度与穗颈伸出度的相关性分析一致，因此，始花前17-12 d(即花粉母细胞形成至减数分裂期)是隐性长穗颈eui基因表达对温度最敏感的时期。在eui基因表达对温度最敏感的时期进行28℃、26℃、24℃、22℃四种人工温度处理，28℃条件下eui基因表达受抑制，有30％的颖花被包在剑叶叶鞘中；26℃-22℃条件下eui基因表达，且穗颈伸出剑叶鞘的长度随温度的降低而增加。(3)在幼穗分化的第Ⅵ期，长选3S和培矮64S之间穗颈节间长度相差不大，从第Ⅶ期开始，长选3S穗颈节间伸长的速度比培矮64S的快。而从第Ⅷ期至始花当天，长选3S穗颈节间伸长的速度显著快于培矮64S的，这一时段长选3S穗颈节间日均伸长的速度是培矮64S的2.2倍，穗颈节间伸长的长度是培矮64S的2.5倍。始花后两者穗颈节间伸长速度逐渐减慢，最后停止伸长。不同发育时期穗颈节间的细胞平均长度和细胞个数也呈现相似的变化规律，即长选3S穗颈节间薄壁细胞个数和长度在Ⅵ期时与培矮64S并无很大差异，随着幼穗的不断发育，细胞长度和细胞个数的差异越来越大，到定长时差异达到最大。长选3S穗颈节间薄壁细胞个数的增加从Ⅶ期到Ⅷ期至始花当天是呈直线式上升趋势，而到了始花之后细胞个数增加速度减慢；薄壁细胞的长度在Ⅶ期至始花当天也显著的增加，但从始花到定长这一阶段细胞长度呈缓慢增长的趋势。人工温度(24℃)条件下长选3S穗颈节间伸长的动态变化、穗颈节间的细胞平均长度及细胞个数的变化规律等与自然条件下所得的结果基本一致。综上所述，长选3S穗颈节间的伸长主要是由幼穗分化前期细胞分裂和细胞伸长共同作用的结果。(4)自然条件下长选3S定长穗颈节间的长度比对照培矮64S的长18.0 cm，其纵列外层和内层薄壁细胞个数分别比培矮64S的多1 248个和580个；外层和内层薄壁细胞的平均长度分别比培矮64S的长23.3μm和38.3μm，尤其是中部区段细胞的平均长度差值最大，长选3S穗颈节间中部区段外层和内层薄壁细胞的平均长度分别比对照的长24.8μm和48.7μm。说明隐性长穗颈温敏核不育水稻穗颈节间伸长是细胞数目增多和细胞长度增加双重作用所致，其后者作用更显著。在不同温度处理后，长选3S穗颈节间最内和最外层薄壁细胞个数和细胞平均长度随处理温度升高逐渐减少；与22℃处理的材料比较，28℃处理的材料穗颈节间短11.79 cm，其纵列最外和最内层薄壁细胞数目分别少771个和292个，细胞平均长度分别短13.9μm和24.6μm。表明eui基因促进细胞分裂和细胞伸长的作用随处理温度的升高逐渐减弱。(5)以培矮64S为对照群体，长选3S为目标群体，进行抑制差减杂交。用经过PA cDNA差减的CX cDNA构建一个差减文库。该文库包含约130个独立的重组克隆，插入片段平均大小为185 bp左右。(6)采用差减前的培矮64S cDNA和长选3S cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针，对随机挑取的96个重组克隆进行差示筛选，结果筛选出与差减前的长选3ScDNA探针和正向差减的cDNA探针都有杂交信号的特异表达克隆4个，只与正向差减的cDNA探针有杂交信号的特异表达克隆16个，共计20个，从20个候选阳性克隆中随机挑取8个进行Northern杂交，证实其中1个候选阳性克隆为长选3S穗颈节间特异表达的cDNA片段。但该基因是否为水稻中的高秆隐性基因(即eui基因)以及它在隐性长穗颈不育水稻穗颈节间伸长过程中的作用，还有待于在获得该cDNA片段的全长、进行更有效地同源性比较和对其进行功能研究后才能确定。综上所述，eui基因具有显著地促进穗颈节间内层薄壁细胞伸长的作用；该基因的表达与育性敏感期(即花粉母细胞形期至减数分裂期)的日均温度呈极显著的负相关，在此时期内如果日均温度在24℃-26℃之间，则能同时满足不育基因和eui基因的充分表达。因此，隐性长穗颈不育水稻在大田生产应用时要注意选择适宜的时间段和地域，既保证隐性长穗颈eui基因能够充分表达，又确保其育性不发生波动；在隐性长穗颈eui基因感温的敏感时期若遇到持续高温天气，在抽穗时则可通过适当喷施赤霉素以确保穗颈节伸出。有关eui基因全序列的获得和其功能确定还需要作大量的研究工作。

论文目录:

缩略词

中文摘要

英文摘要

第一章绪论

1 作物杂种优势的遗传机理研究进展

2 作物杂种优势的分子生物学研究进展

3 作物杂种优势预测方法研究

4 水稻杂种优势的利用

5 水稻隐性长穗颈种质的研究进展

6 植物激素在水稻茎伸长生长过程中的作用

7 抑制性差减杂交技术及其在植物差异表达基因分离中的应用

8 研究背景、目的与意义

第二章自然条件下隐性长穗颈温敏核不育水稻穗颈伸出度及穗颈节间的细胞学观察

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 材料栽培与茎秆长度的测定

1.2.2 不同发育时期穗颈节间长度变化观察

1.2.3 穗颈节间细胞切片制备与观察

2 结果与分析

2.1 隐性长穗颈温敏核不育系与对照材料茎秆各节间长度的比较

2.2 穗颈节间细胞数目和细胞平均长度的比较

2.3 穗颈节间不同区段薄壁细胞数目和长度变化的比较

2.4 自然条件下长选3S不同发育时期穗颈节间长度变化规律

2.5 自然条件下长选3S不同发育时期穗颈节间细胞数目和长度的比较

3 讨论

第三章温度对隐性长穗颈温敏核不育水稻穗颈节伸出长度的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 自然温度记录与穗颈伸出长度的测定

1.2.2 人工温度处理

1.2.3 人工温度(24℃)条件下穗颈节间伸长的动态变化观察

1.2.4 不同温度处理后穗颈节间细胞切片制备与观察

2 结果与分析

2.1 自然条件下穗颈伸出长度与始花前不同时段日均温度的相关性分析

2.2 始花前不同时期人工24℃温度处理对穗颈节伸出长度的影响

2.3 敏感期24℃条件下不同处理天数对穗颈伸出长度的影响

2.4 人工温度(24℃)条件下长选3S穗颈节伸长的动态变化

2.5 敏感期不同人工温度处理对穗颈伸出长度的影响

2.6 不同温度处理后定长穗颈节间细胞数目和长度的比较

3 讨论

第四章利用SSH技术分离隐性长穗颈温敏核不育水稻穗颈节间特异表达的cDNA片段

1 主要试剂

2 主要仪器

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 方法

3.2.1 材料处理及取样

3.2.2 总RNA抽提

3.2.3 mRNA的分离纯化

3.2.4 抑制差减杂交

3.2.5 差减cDNA文库的构建

3.2.6 差示筛选消减cDNA文库

3.2.7 Northern杂交

4 结果与分析

4.1 总RNA的提取及mRNA分离纯化

4.2 长选3S消减cDNA文库的构建及筛选

4.3 候选阳性克隆的Northern杂交分析

4.4 阳性重组克隆的序列测定

5 讨论

本研究的主要创新之处

参考文献

致谢

作者简历

附录

发布时间: 2007-12-06

参考文献

[1].水稻长穗颈基因eui的作用机理[D]. 季兰.福建农林大学2001
[2].栽培稻抗旱性状评价与定位及其育种应用[D]. 刘国兰.华中农业大学2008

水稻隐性长穗颈（eui）基因表达的基础生物学研究

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