甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育两型系9012AB雄性不育基因的分子标记开发

论文摘要

油菜杂种优势利用是提高产量、缓解产量与品质矛盾、增强抗（耐）逆性的有效途径,而高效授粉系统的发掘与利用则是杂交种子生产的关键环节。油菜隐性细胞核雄性不育因其具有不育性彻底且稳定、恢复源广等优点,在国内已经成为杂种优势利用的一个重要途径,但由于得不到100%的不育系,在杂交制种时需人工拔除不育系株行中50%的可育株,限制了其广泛应用。陈凤祥等（1993）发现了甘蓝型油菜隐性上位互作核不育材料,并提出了隐性核不育的上位互作模式,为隐性核不育的“三系”配套提供了理论依据,为核不育的广泛应用奠定了基础。该隐性上位互作核不育的育性受两对重叠隐性不育基因（ms3和ms4）和一对隐性上位抑制基因（rfrf）互作控制,隐性上位基因纯合时对隐性不育基因起抑制作用。为了使隐性核不育得到更加广泛的应用,有必要对其核不育基因进行深入研究。本研究以甘蓝型油菜隐性上位互作核不育两型系9012AB为材料,采用AFLP和SSR技术寻找与育性基因Ms3位点（可育等位基因Ms3和不育等位基因ms3）紧密连锁的分子标记,构建目标基因区域的连锁图谱,并利用芸苔属作物与拟南芥的同源性和共线性开展目的基因的生物信息学研究工作,取得的实验结果和主要结论如下:1.将甘蓝型油菜隐性上位互作核不育两型系9012AB中的可育株（9012B）与不育株（9012A）进行人工杂交,在F1和F2代中连续选择可育株套袋自交,收获40个F2的自交后代,在F3代对这些F2:3株系进行育性调查,其结果显示:有29个株系出现3:1的育性分离,11个株系育性不分离,表现为100%可育。说明9012AB中控制育性的基因有一对是杂合的,从其自交后代中选择纯合可育的单株构建可育池,用不育株构建不育池。2.在甘蓝型油菜隐性上位互作核不育两型系9012AB的可育株自交后代F3中选取基因型为ms3ms3ms4ms4RfRf的16个不育单株,从上述11个育性不分离的株系中选取基因型为Ms3Ms3ms4ms4RfRf的16个可育单株提取DNA,应用BSA法构建了两个可育基因池和两个不育基因池,在四个基因池之间一共筛选了512对AFLP引物,找到了18个与目标基因紧密连锁的分子标记,其中,有8个标记（YWA、YWB、YWC、YWD、YWF、YWG、YWH、YWI）为相引标记;9个标记（YWJ、YWK、YWL、YWM、YWN、YWO、YWP、YWQ、YWR）为相斥标记;1个为共显性标记（YWE）。用192个F2群体的单株对与不育基因相引的标记进行遗传连锁分析,结果表明,各标记均位于目标基因的同一侧,最近标记与目标基因的遗传距离为1.4 cM;用192个BC1群体中的单株对与不育基因相斥的标记进行了遗传连锁分析,结果表明,与目标基因连锁最紧密的标记的遗传距离为1.3 cM,除标记YWM位于目标基因的一侧外,其余标记均分布于目标基因的另一侧。对所有标记都进行了回收、克隆、测序,其中4个标记（YWB,YWD,YWJ,YWK）成功地转化为了SCAR标记。3.从753对SSR引物中筛选得到两个与不育基因ms3紧密连锁的标记SSR100和SSR189,其遗传距离分别为1.1 cM和2.0 cM。4.采用盆穴育苗移栽法构建了来源于9012B的自交后代的1 240个单株的近等基因系群体,利用与不育基因紧密连锁的SCAR标记对1 240个单株进行分析,得到4个标记（SYWB、SYWD、SYWJ和SYWK）与目的基因间更精确的遗传距离。其遗传距离分别为5.1 Cm、1.2 cM,0.1 cM和0.3cM。5.将筛选、转化得到的SCAR标记应用于育种实践,发现标记SYWD在多种类型的材料中具有多态性,能够运用于新的隐性核不育系的转育和恢复系、临保系的筛选。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 油菜的杂种优势利用现状
• 1.2 油菜杂种优势利用的途径
• 1.2.1 细胞质雄性不育
• 1.2.2 细胞核雄性不育
• 1.2.3 细胞核+细胞质雄性不育
• 1.2.4 生态型雄性不育
• 1.2.5 自交不亲和
• 1.2.6 化学杀雄
• 1.2.7 化学复雄
• 1.2.8 其它利用途径
• 1.3 油菜细胞核雄性不育的研究
• 1.3.1 油菜细胞核雄性不育的育性表现
• 1.3.2 油菜细胞核雄性不育的遗传分类
• 1.3.2.1 一对复等位基因控制的细胞核雄性不育
• 1.3.2.2 两对显性基因互作控制的细胞核雄性不育
• 1.3.2.3 两对隐性基因控制的细胞核雄性不育
• 1.3.2.4 隐性上位基因互作控制的细胞核雄性不育
• 1.3.2.5 转基因的细胞核雄性不育
• 1.3.3 油菜细胞核雄性不育的分子机理研究
• 1.3.4 油菜细胞核雄性不育基因的分子机理研究
• 1.4 分子标记在油菜遗传改良中的应用
• 1.4.1 常用的分子标记
• 1.4.2 油菜分子标记遗传图谱的构建和重要基因的定位
• 1.4.3 分子标记辅助选择在油菜遗传育种中的应用
• 1.5 芸薹属作物和拟南芥基因组比较研究
• 2 本研究的目的和意义
• 3 甘蓝型油菜隐性上位互作核不育两型系9012AB的分子标记开发
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验群体的构建
• 3.1.3 育性调查及DNA的提取
• 3.1.4 AFLP分析
• 3.1.4.1 总DNA的酶切与连接
• 3.1.4.2 预扩增
• 3.1.4.3 选择性扩增
• 3.1.4.4 扩增产物的PAGE胶检测
• 3.1.4.5 差异片段的记录及群体验证
• 3.1.5 AFLP标记的SCAR转化
• 3.1.5.1 差异片段的回收及再扩增
• 3.1.5.2 连接反应
• 3.1.5.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.1.5.4 重组子筛选、鉴定
• 3.1.5.5 克隆片段的测序及其序列相似性分析
• 3.1.5.6 SCAR引物设计
• 3.1.5.7 PCR扩增和群体分析
• 3.1.6 连锁遗传分析
• 3.1.7 SCAR引物的大群体分析及连锁遗传分析
• 3.1.8 各标记序列与拟南芥序列的同源性比较
• 3.1.9 SSR标记的筛选
• 3.1.10 SCAR标记的多态性检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 育性调查结果
• 3.2.2 AFLP引物的筛选
• 3.2.3 与雄性不育基因ms3连锁的AFLP标记
• 3.2.4 差异片断的回收与克隆
• 3.2.5 差异片段的序列分析及SCAR标记的转化
• 3.2.7 SCAR标记的群体分析
• 3.2.8 各标记序列与拟南芥序列的同源性比较
• 3.2.9 SSR标记的筛选
• 3.2.10 SCAR标记在部分油菜材料中的多态性检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于标记筛选技术和群体对标记筛选的影响
• 3.3.1.1 SSR标记与AFLP标记筛选效率的比较
• 3.3.1.2 不同筛选群体对标记筛选的影响
• 3.3.2 AFLP标记及其向SCAR标记的转化
• 3.3.3 利用与雄性不育基因连锁的分子标记辅助选育新型临保系
• 4 参考文献
• 5 附录
• 作者简历
• 致谢