一株鞘氨醇杆菌代谢咔唑的分子机制研究

论文摘要

鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）是1990年划分的一个新属,该属细菌在环境中分布广泛,并且有很强的代谢能力,这使得鞘氨醇单胞菌在环境污染治理与工业生产领域具有广阔的应用前景。在本论文中,我们对一株咔唑降解菌XLDN2-5进行了分类鉴定并研究了其对咔唑的降解特性。菌株16S rDNA经测序及序列比对结果显示,XLDN2-5与Sphingobium yanoikuyae DSM7462有99%的相似性。对于XLDN2-5细胞脂肪酸和生理生化分析也取得类似的结果,XLDN2-5被鉴定为Sphingobium yanoikuyae。苯并噻吩（Benzothiophenes, BT）是煤焦油中一种有毒并且很难降解的成分。我们考察了不能以BT为唯一碳源生长的咔唑降解菌株XLDN2-5对BT的共代谢特性。我们同时研究了XLDN2-5对2-methylbenzothiophene （ 2MBT ）和5-methylbenzothiophene （ 5MBT ）的共代谢转化特性。而对于3-methylbenzothiophene的共代谢研究发现,该化合物能够完全抑制菌株XLDN2-5以咔唑为碳源和氮源生长。通常,XLDN2-5共代谢BT,2MBT,和5MBT生成相应的亚砜和砜。对于BT的降解产物我们除了检测到砜和亚砜之外,利用气相质谱连用仪（GC-MS）我们还检测到几个高分子量的含硫芳香化合物,包括6a,11b-dihydrobenzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene-7-oxide benzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene, benzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene-7-oxide, 6a,11b-dihydrobenzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene,和一个新产物6,12-epithiobenzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene,经推测这些高分子量的产物是通过Diels-Alder反应形成的。GC-FID分析发现大约17%的BT转化生成benzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene。通过好氧降解反应转化BT生成砜和亚砜类产物可以减少毒性和有利于BT的完全降解。然而,形成的更难以降解的高分子量化合物如benzo[b]naphtho[1,2-d]thiophene则会影响其生物降解。环境中的细菌能够通过获得外源基因的方式建立一条代谢环境异源物质的途径,这使其能够更好的适应环境并得以生存。通常来说,外源基因的获得往往是通过可移动遗传元件如质粒、转座子和插入序列等的介导下获得。在本论文中我们从咔唑降解菌XLDN2-5中克隆了编码咔唑降解的上游途径基因簇,途径通过有角度途径降解咔唑生成邻氨基苯甲酸,然后邻氨基苯甲酸被进一步代谢生成邻苯二酚。这个咔唑有角度双加氧降解途径的上游基因簇的组织形式为IS6100::ISSsp1-ORF1-carRAaBaBbCAc-ORF8-IS6100-fdr-IS6100,降解基因被插入序列IS6100包裹形成类似三明治的结构。在该途径中,咔唑在咔唑有角度双加氧酶（CARDO）、间位开环裂解酶和水解酶作用下生产邻氨基苯甲酸。基因fdr编码一个新的黄素蛋白还原酶,当该酶不存在时CarAa和CarAc的活性很低。有趣的是,编码邻氨基苯甲酸降解的基因簇也被插入序列IS6100包裹形成类似三明治的结构:IS6100-antRAcAdAbAa-IS6100。邻氨基苯甲酸双加氧酶由还原酶（AntAa）、黄素蛋白（AntAb）和一个双组份的末端双加氧酶组成。通过RT-PCR发现这些基因在咔唑存在的时候才表达,说明这些基因应该是诱导型的。通过在大肠杆菌转化实验发现当Fdr或AntAa蛋白不存在时,CARDO和ANTDO只有微弱的活性。另外,由于car和ant基因簇两端都有插入序列IS6100,这说明这些基因可能都是通过基因水平转移获得的。这个基因的组织形式给了一个很好的代谢途径基因簇进化的例子。在研究上游途径的基础上,我们进一步研究了XLDN2-5代谢咔唑的下游途径。通过筛选基因组文库,我们克隆得到了邻苯二酚间位裂解途径的基因簇。这个基因簇由carLM-catS-carJK-catR-carDEFGHIYX 14个基因组成,其中12个基因组成三个操纵子,分别为carJK、carDEFGHIYX和carLM。另外两个是调节基因catR和catS,其编码的蛋白CatR和GatS分别是GntR和IclR蛋白家族的成员。XLDN2-5中的邻苯二酚间位裂解途径的基因排列顺序与来源于假单胞菌中的邻苯二酚降解基因簇xyl、dmp和bph有明显的差异。更令人惊讶的是该基因簇与来源于sphingomonads的基因簇也大不一样。因此,XLDN2-5的邻苯二酚间位裂解途径基因具有新型的基因排列方式,是一个新的基因簇。最后,我们对XLDN2-5的全基因组进行了测序分析,通过拼接、注释发现,该菌株中含有大量的插入序列等可移动元件。咔唑有角度降解途径的基因都在一个质粒上,该质粒命名为pCar4。另外,通过比较蛋白组发现,咔唑降解相关的蛋白在咔唑存在的时候表达,在葡萄糖存在的时候不表达。总之,本论文系统的对一株咔唑降解菌进行了鉴定并研究了其相关的代谢途径和代谢基因,最后我们对其基因组进行了测序分析,并做了比较蛋白组研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 鞘氨醇单胞菌的系统分类
• 1.2 鞘氨醇单胞菌代谢多样性
• 1.2.1 微生物多糖
• 1.2.2 降解环境污染物
• 1.3 鞘氨醇单胞菌降解基因的组织形式
• 1.4 代谢质粒、质粒穿梭及插入序列的多样性
• 1.5 咔唑的微生物降解
• 1.5.1 上游途径
• 1.5.2 下游途径
• 1.5.3 咔唑降解基因簇
• 1.5.4 咔唑降解基因的调控
• 1.6 本课题的研究意义
• 第二章 一株咔唑降解菌XLDN2-5 的分类鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要仪器和试剂
• 2.1.2 菌株鉴定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 表型分析
• 2.2.2 脂肪酸分析
• 2.2.3 生理生化分析
• 2.2.4 进化树构建
• 2.3 本章小结
• 第三章 鞘氨醇杆菌XLDN2-5 代谢咔唑及苯并噻吩类化合物产物及途径分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器和试剂
• 3.1.2 XLDN2-5 代谢咔唑和苯并噻吩类化合物产物分析
• 3.1.3 分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 咔唑降解产物分析
• 3.2.2 苯并噻吩类化合物产物分析
• 3.3 本章小结
• 第四章 咔唑降解基因的克隆及功能验证
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要仪器和试剂
• 4.1.2 XLDN2-5 基因组文库构建
• 4.1.3 DIG 探针标记
• 4.1.4 菌落杂交
• 4.1.5 杂交
• 4.1.6 染色体步移
• 4.1.7 基于IS6100 的PCR
• 4.1.8 RT-PCR
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 菌落杂交结果
• 4.2.2 染色体步移
• 4.2.3 基于插入序列的PCR
• 4.2.4 car 和ant 基因簇以及fdr 基因位置关系的确定
• 4.2.5 咔唑的上游降解基因簇分散在插入序列组成的复合转座子上
• 4.2.6 car 和ant 基因簇的RT-PCR 转录数据分析
• 4.2.7 验证含有XLDN2-5 咔唑双加氧酶和邻氨基苯甲酸序列的转化子活性
• 4.2.8 产物鉴定
• 4.2.9 XLDN2-5 与已报道的car 和ant 基因簇的对比
• 4.3 本章小结
• 第五章 新的邻苯二酚降解基因簇的克隆及分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 基因组文库构建和筛选
• 5.1.3 生物信息学分析
• 5.1.4 RT-PCR
• 5.1.5 启动子预测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 基因组文库的筛选和序列分析
• 5.2.2 RT-PCR
• 5.2.3 carD 和carE 基因的功能分析
• 5.2.4 CarF, CarL, CarC: 三个催化底物或功能相近的蛋白
• 5.2.5 基因carG 和carH：重复基因的一个例子
• 5.2.6 CarJ 和CarK 蛋白的共表达
• 5.2.7 CarM：一个新的醛缩酶
• 5.2.8 CarY 和CarX:两个假定的信号蛋白
• 5.2.9 新的邻苯二酚间位裂解途径基因组织形式
• 5.3 本章小结
• 第六章 咔唑降解基因的稳定性分析及有角度双加氧酶电子传递链的可替代性研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 咔唑降解突变株的获得及咔唑降解基因丢失情况考察
• 6.1.2 分子克隆
• 6.1.3 重组PCR
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 咔唑降解突变株的筛选及检测
• 6.2.2 重组PCR
• 6.3 本章小结
• 第七章 鞘氨醇杆菌XLDN2-5 的全基因组测序及组学分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 测序方法
• 7.1.2 基因组拼接
• 7.1.3 蛋白质组分析
• 7.1.4 蛋白组聚类分析
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 454 拼接结果
• 7.2.2 覆盖倍数的确定
• 7.2.3 插入片段长度的确定
• 7.2.4 菌株XLDN2-5 与四株已经测序的鞘氨醇单胞菌的比对分析
• 7.2.5 菌株XLDN2-5 基因组拼接结果
• 7.2.6 XLDN2-5 基因组中苯甲酸降解基因分析
• 7.2.7 XLDN2-5 基因组中类胡萝卜素合成基因分析
• 7.2.8 蛋白质组分析结果
• 7.3 本章小结
• 结束语
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间论文发表及专利申请情况
• 致谢