论文摘要
目的血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）可以动态调节物质在血液循环和脑组织的交换,保持脑组织内环境的动态稳定,同时也限制了药物进入中枢神经系统。药物通过血肿瘤屏障一般有两种途径:细胞旁途径和跨细胞途径。研究表明小剂量缓激肽（bradykinin,BK）可以选择性开放血肿瘤屏障（blood-tumor barrier,BTB）,而不影响正常脑组织。但BK选择性开放BTB的机制还不是很清楚,有研究对体外BTB模型的跨内皮细胞阻抗（transendothelial electrical resistance,TEER）进行了测量,发现BK作用后,BTB的TEER值降低,紧密连接（tight junction,TJ）开放;但到目前为止关于BK是否能够开放TJ仍有争议;而且没有进一步阐述BK开放TJ的机制。此外,很多研究都显示BK能够通过增加跨内皮细胞吞饮小泡的数量增加BTB的通透性。经典的跨细胞转运包括clathrin包被途径、caveolae诱导的内化途径和其他的clathrin/caveolae非依赖机制。BK究竟通过哪条跨细胞途径增加吞饮小泡仍不清楚。cAMP是细胞内重要的第二信使,参与多种信号通路的调节。很多研究表明cAMP能够上调紧密连接相关蛋白的水平,增加内皮细胞的跨细胞阻抗值,从而加强紧密连接的紧密度。此外,cAMP可通过蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）依赖或非依赖途径调节紧密连接。但cAMP/PKA途径是否参与BK开放紧密连接还不清楚。本研究为了明确缓激肽与B2受体结合后是否能够通过调节紧密连接相关蛋白开放紧密连接,cAMP/PKA信号分子是否参与了缓激肽开放紧密连接的调节过程,以及是否caveolae介导缓激肽增加内皮细胞的吞饮小泡。方法1、大鼠C6脑胶质瘤模型和体外血肿瘤屏障模型的制备。2、应用伊文氏兰（evans blue,EB）检测缓激肽作用前后脑胶质瘤大鼠血肿瘤屏障渗透性变化,透射电镜技术检测内皮细胞间紧密连接的状态和内皮细胞中吞饮小泡数量的改变。3、应用millipore公司的Millicell-ERS电阻测量系统测量体外血肿瘤屏障的TEER值。4、应用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）实验检测体外血肿瘤屏障的通透性。5、应用免疫组织化学和免疫荧光法检测缓激肽作用后脑胶质瘤大鼠和体外血肿瘤屏障模型上紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和细胞骨架蛋白F-actin的分布和表达水平的变化;检测脑胶质瘤大鼠caveolin-1和caveolin-2的分布和表达水平变化。6、应用Western blot法检测缓激肽作用前后脑胶质瘤大鼠和体外血肿瘤屏障模型上紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白质表达水平;检测脑胶质瘤大鼠脑组织中caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达水平。7、分别应用放射免疫法检测缓激肽作用前后脑胶质瘤大鼠脑组织中cAMP的含量和PKA催化亚单位的蛋白表达水平。结果1、成功建立了大鼠C6脑胶质瘤模型和体外血肿瘤屏障模型。2、缓激肽作用后,C6脑胶质瘤大鼠紧密连接开放,血肿瘤屏障渗透性增加;体外血肿瘤屏障模型的TEER值降低,HRP通透性增加。上述各指标在缓激肽作用15min时变化最明显,以后逐渐恢复。3、C6脑胶质瘤大鼠脑组织中微血管上的紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和细胞骨架蛋白F-actin在缓激肽作用后表达减少,在15 min时达最低值,以后逐渐恢复。4、缓激肽作用后,体外血肿瘤屏障模型上内皮细胞紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5由沿着细胞边缘连续分布变为不连续,上述指标的蛋白表达水平降低;细胞骨架蛋白F-actin在细胞边缘的分布减少,应力纤维增加。5、缓激肽作用后,C6脑胶质瘤大鼠脑组织中caveolin-1的蛋白表达水平增加,在缓激肽作用15 min时达峰值,以后逐渐恢复;而caveolin-2在缓激肽作用的各时间点无明显变化。6、缓激肽作用后,C6脑胶质瘤大鼠脑组织中cAMP的含量减少,PKA催化亚单位的蛋白表达水平降低,二者均在缓激肽作用15 min时变化最明显。讨论我们的研究证明,BK作用后,TJ开放,吞饮小泡数量增加,BTB的通透性显著增加。TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达都显著低于对照组,在BK作用15 min达最低值;并且TJ相关蛋白和细胞骨架蛋白F-actin的分布也发生了改变。同时发现质膜微囊结构蛋白caveolin-1的表达水平显著高于对照组,在BK作用15 min达峰值,而caveolin-2的表达水平没有变化。上述结果说明,BK能够通过开放TJ的细胞旁途径和增加吞饮小泡数量的跨细胞途径增加BTB的通透性。缓激肽是生物活性物质,小剂量BK能有效增加血肿瘤屏障的通透性,而不影响正常脑组织。我们通过伊文氏兰实验也验证了上述观点,伊文氏兰的通透性在BK作用15 min时达到最大值。目前关于BK是通过细胞旁还是跨细胞途径开放BTB还不是很清楚。很多研究认为,缓激肽主要通过跨细胞途径增加血肿瘤屏障的通透性,Black等人应用透射电镜对缓激肽作用后的微血管内皮细胞吞饮小泡的变化进行了系统的研究,发现缓激肽作用后吞饮小泡的数量明显增加,我们透射电镜的结果与其相一致,缓激肽可以使吞饮小泡的数量增加,在缓激肽作用15min时吞饮小泡的数量最多。Sanovich等人在研究BK类似物RMP-7开放血脑屏障的途径时发现,PMP-7可通过开放TJ的细胞旁途径转运药物;Easton等人的体外研究也表明BK可降低内皮细胞的TEER,从而开放紧密连接。我们应用透射电镜观察BK对脑胶质瘤大鼠微血管TJ的影响时发现,BK作用后TJ显著开放,在BK作用15 min时开放最明显。此外,我们的体外实验也证明,BK能够降低体外BTB模型的TEER值;并且以时间依赖的方式增加HRP的通透性。二者均在BK作用15 min时变化最明显。综上所述,我们认为,BK能够选择性开放BTB的TJ,增加吞饮小泡的数量,但确切的分子机制还不清楚。为了弄清BK开放TJ的分子机制,我们检测了TJ相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5以及细胞骨架蛋白F-actin的分布和表达变化。ZO-1是第一个被确定的TJ相关蛋白,它是MAGUK家族（含有鸟苷酸激酶区域或GUK结构域的一个家族）成员之一。越来越多的证据显示ZO-1的缺失会导致TJ结构的破坏。Occludin是研究的最清楚的TJ跨膜蛋白,普遍认为它直接参与TJ的屏障和栅栏功能。Claudin-5是脑内皮细胞TJ一个主要的细胞黏附分子,他可能直接参与BBB的建立和通透性的调节。我们的结果显示,BK能够减少紧密连接相关蛋白的表达水平并改变其分布,最明显的变化出现在BK灌注15 min时,这与EB、TEER和HRP达到峰值的时间相一致,这说明BK可通过下调紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表达开放TJ。最近的研究显示,F-actin在TJ复合物的结构支持和功能调节中都有重要作用,从而能够调节BBB的通透性。我们应用荧光显微镜观察F-actin的变化,结果显示BK灌注后F-actin出现了明显的解聚。大量的体内外研究显示,TJ相关蛋白与细胞骨架蛋白相互作用共同维持TJ的完整性。因此,我们认为,BK可能通过影响F-actin的作用调节TJ相关蛋白的结构和功能,从而引起TJ开放。跨细胞途径可以转运白蛋白大小相似或比其大的血浆蛋白,主要通过细胞表面的caveolae介导的囊泡载体的内吞过程实现的。特定的信号可引起caveolae的内吞,并转移到内皮的基膜侧。Caveolin-1是形成caveolae所必需的主要结构蛋白,敲除caveolin-1后,caveolae完全缺失。此外,caveolin-1在调节囊泡运输中也起重要作用,它可以通过控制信号分子的活性和定位调节囊泡的分裂、内吞、融合和胞吐作用。为了进一步弄清介导缓激肽增加吞饮小泡数量的机制,我们应用免疫组化、双重免疫荧光和Western blot等方法检测了缓激肽对caveolin-1和caveolin-2的分布和蛋白表达水平的变化。结果显示,缓激肽作用后caveolin-1在脑微血管内皮细胞上的表达水平增加,在缓激肽作用15 min时达到峰值;而缓激肽对caveolin-2的表达水平没有影响。Caveolin-1的表达水平变化与吞饮小泡变化的时程相同,由此我们认为,缓激肽可能通过上调caveolin-1的表达水平增加吞饮小泡的数量,从而调节血肿瘤屏障的通透性。上述结果证明,BK能够通过影响紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和细胞骨架蛋白F-actin开放紧密连接;通过增加质膜微囊结构蛋白caveolin-1的表达增加吞饮小泡的数量,从而增加血肿瘤屏障的通透性。我们首次在分子水平上证明,BK能够通过开放紧密连接的细胞旁途径和增加吞饮小泡的跨细胞途径增加血肿瘤屏障的通透性。结论1、缓激肽能开放紧密连接,增加吞饮小泡的数量,选择性增加血肿瘤屏障的通透性。2、缓激肽能使紧密连接相关蛋白ZO-1、occludin、claudin-5和细胞骨架蛋白F-actin的表达减少,此作用与缓激肽诱导紧密连接开放有关。3、缓激肽能促进C6胶质瘤大鼠脑组织中caveolin-1的表达增加,caveolin-1表达的上调与缓激肽作用后吞饮小泡数量的增加有关。4、缓激肽可抑制cAMP和PKA催化亚单位的表达,提示缓激肽可通过cAMP/PKA途径开放紧密连接。5、缓激肽可通过跨细胞和细胞旁两条途径选择性增加血肿瘤屏障的通透性。