RhoA在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的功能及其机制研究

论文摘要

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤。由于乳腺癌细胞异常的增殖能力，远处脏器的转移能力，以及对现有治疗药物的抵抗能力，使其成为严重危害女性健康的“头号杀手”。尽管乳腺癌的早期诊断、治疗手段和预后检测水平不断提高，但是乳腺癌患者的死亡率仍旧得不到有效的控制。抗血管生成治疗作为一种肿瘤生物治疗手段越来越受到重视，它不仅可以切断肿瘤原发灶的营养供给，而且可以通过抑制新生血管的生成而控制肿瘤的远处转移。但是，目前有关肿瘤新生血管的研究相对较少，其分子机制还不完全清楚，寻找到血管生成通路上游的开关分子意义重大。RhoA作为小G蛋白家族中的一员，参与了肿瘤的转移、侵袭、增殖、凋亡和周期调控等多个环节，并且扮演着众多信号通路分子开关的角色。然而，有关RhoA在肿瘤新生血管中的作用机制尚无明确的定论。缺氧作为一种应激因素，贯穿于肿瘤发生发展的全过程。缺氧不仅可以影响肿瘤相关因子的转录表达，而且为新生血管的发生提供了“温床”。那么，RhoA是否在缺氧诱导的肿瘤新生血管中发挥作用呢？我们能否从RhoA入手去调控血管生成的信号通路呢？带着这样的疑问，我们进行了RhoA在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的功能及其机制的研究。研究方法和结果：1、RhoA在乳腺癌细胞系中的表达分析及对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响：（1）通过RT-PCR和western blot分别检测六株乳腺癌细胞系和一株正常乳腺上皮细胞系中RhoA的表达情况；（2）转染针对人RhoA的小干扰RNA，western blot和RT-PCR验证其干涉效率；（3）通过MTT实验、单层细胞划痕实验、细胞周期和凋亡检测实验观察siRhoA对MCF-7细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响；（4）通过裸鼠移植瘤内注射siRhoA实验和免疫组化分析，观察siRhoA对移植瘤生长和VEGF表达的影响。结果：RhoA在乳腺癌细胞系中差异性表达，这种表达的差异性与细胞的侵袭转移能力有关；siRhoA能够有效地逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，并且体外瘤内注射同样能够发挥抑瘤和抑制血管的作用。2、RhoA在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的生物功能分析：（1）ELISA检测缺氧条件下，MCF-7细胞中RhoA对VEGF分泌水平的影响；（2）建立MCF-7/HUVEC共培养模型，观察在缺氧刺激下，MCF-7细胞中RhoA活性的变化对HUVEC增殖、迁移、管腔和F-actin形成的影响。结果：缺氧条件下，活性RhoA可以促进MCF-7细胞VEGF的分泌，沉默RhoA可以抑制VEGF的分泌；在共培养模型中，当MCF-7细胞中RhoA活化时，可以促进HUVEC增殖、迁移、管腔和F-actin的形成，而MCF-7细胞中RhoA沉默时，则HUVEC的上述生物学行为受到抑制。3、RhoA在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的分子机制研究：（1）western blot检测缺氧对RhoA、p53、HIF-1α和VEGF蛋白水平的影响及RhoA对这三个分子的调控作用；（2）共聚焦显微镜观察缺氧情况下RhoA对p53核转位的影响；（3）western blot和免疫共沉淀检测RhoA调控p53的信号通路。结果：缺氧可以抑制p53的表达，促进RhoA、HIF-1α和VEGF的表达；RhoA激活后能够抑制p53的表达，促进HIF-1α和VEGF的表达，而RhoA沉默后能够上调p53的表达，下调HIF-1α和VEGF的表达；缺氧条件下，RhoA的活化可以促进p53的入核，而沉默RhoA则p53的入核作用明显减弱；Akt/MDM2和泛素-蛋白酶体通路可能参与了RhoA对缺氧诱导肿瘤血管生成的分子机制中。结论：（1）RhoA在乳腺癌细胞系中差异性表达，这可能与细胞的转移侵袭能力有关；（2）siRhoA可以逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为，移植瘤内注射可以抑制肿瘤的生长和VEGF的表达；（3）在缺氧刺激下，RhoA可能通过调控VEGF的表达水平，间接地影响HUVEC细胞的增殖、迁移、管腔和F-actin形成能力，从而参与肿瘤新生血管的形成过程中；（4）缺氧条件下，RhoA通过对血管抑制因子p53的调节来影响血管生成因子HIF-1α和VEGF的表达，参与肿瘤血管的生成。这一作用机制可能是通过Akt/MDM2和泛素-蛋白酶体通路实现的。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 RhoA 在乳腺癌细胞系中的表达分析及对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 RhoA 在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的生物功能分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 RhoA 在缺氧诱导的乳腺癌新生血管形成中的分子机制的研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢