水稻条纹病毒编码的.SP蛋白功能及其与寄主因子PsbP的互作研究

论文摘要

由水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）引起的水稻条纹叶枯病是目前我国水稻生产上最具威胁性的病毒病之一。近年来该病在我国不同省市水稻产区多次爆发,甚至流行成灾,使水稻生产受到严重影响,造成巨大的经济损失。RSV基因组RNA4的病毒链编码一个病害特异蛋白（disease-specific protein, SP）。过去研究发现SP蛋白在病叶中的积累量与褪绿花叶症状的严重程度成正相关,推测该蛋白是致病相关蛋白,但SP蛋白的具体功能至今还没有相关报道。为了弄清SP蛋白在RSV侵染及致病中的作用,本论文对SP蛋白的功能及其与寄主因子的互作机理进行了研究。利用马铃薯X病毒（Potato virus Ⅹ）异源病毒载体表达SP基因并侵染本氏烟,与PVX空载体侵染的植株相比,SP蛋白的表达能够显著加重症状。根据在线蛋白结构预测网站（http://www.predictprotein.org）的分析结果,对SP基因进行无义突变和缺失突变,并将各突变体构建到PVX载体上浸润本氏烟。结果发现当SP缺失了C端52个氨基酸（muSP4）时,致病能力显著减弱,症状接近于PVX空载体侵染的植株。利用转基因技术将SP基因分别整合入本氏烟和水稻的基因组中,并将muSP4基因也整合入本氏烟基因组中,Northern和Western印迹分析表明SP及muSP4基因能够在这些转基因植株中正常转录翻译,但植株没有任何异常表型。进一步在转基因植株上接种RSV病毒,与转空载体植株相比,转SP基因植株发病明显提前,症状加重,并且Northern blot检测到病毒积累量也显著增多,而RSV在转muSP4基因植株和在转空载体植株上的侵染效率无明显差异。表明SP蛋白的表达提高了病毒的侵染效率,且SP的C端结构域起关键作用。以RSV SP蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统从水稻cDNA文库中筛选与SP蛋白互作的水稻寄主因子。通过营养缺陷型培养基和ABA抗生素筛选,并进一步通过回转验证,最终确定了OsPsbP蛋白是与SP互作的水稻寄主因子之一。序列比对分析发现水稻、普通烟、大麦、竹子编码的PsbP基因具有很高的氨基酸同源性。克隆本氏烟中的PsbP全长cDNA（NbPsbP）构建到pGADT7载体上,并将SP各个突变体基因构建到pGBKT7载体上,经酵母双杂交实验验证发现SP与NbPsbP蛋白也能互作,而muSP4不能与两种PsbP蛋白互作。通过双分子荧光互补试验证实SP和PsbP蛋白能够在烟草表皮细胞中互作,并且互作主要发生在细胞质和细胞核中,而muSP4在植物体内同样不能与PsbP蛋白互作。将SP和PsbP两个蛋白体外表达纯化,通过GST pull-down实验进一步证实两个蛋白在体外也能互作。为了进一步了解RSV SP与PsbP的互作机理,利用转基因和RNAi技术获得PsbP过表达和表达下调的水稻和本氏烟植株,通过real-time RT-PCR、Northern blot和Western blot实验证实PsbP确实显著上调或者下调。观察发现PsbP表达下调的植株叶片轻微发白,生长迟缓,而过表达植株表型正常。通过光合作用相关参数测定实验发现PsbP表达下调的本氏烟与转SP基因本氏烟叶片中的净光合速率、电子传递效率和最大光化学效率均显著下降,说明在这些植株中光合作用受到抑制。常温包埋叶片并电镜观察发现PsbP表达下调后细胞中的叶绿体结构紊乱,片层结构疏松濒临瓦解,而在转SP基因和感染RSV的植株细胞中也出现了类似的现象。在烟草细胞中对PsbP蛋白进行亚细胞定位,将PsbP与GFP的融合表达载体在本氏烟叶片中进行瞬时表达,36小时后提取原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现PsbP融合蛋白在野生型本氏烟中仅定位于叶绿体,而在转SP基因的本氏烟中除了定位于叶绿体,还定位于细胞质,说明SP蛋白的存在能够改变PsbP的亚细胞定位。进一步通过免疫胶体金标记实验检测PsbP蛋白在各种处理的植株叶绿体中的积累量和定位情况,发现在PsbP表达下调的植株细胞中PsbP蛋白仅定位于叶绿体中,但是积累量是野生型本氏烟的25%左右,而在感染RSV和转SP基因的植株细胞中PsbP蛋白定位于叶绿体、细胞质和线粒体中,并且在叶绿体中的积累量显著下降到对照的35-60%。在转muSP4基因的本氏烟中PsbP蛋白的定位和积累量与对照没有显著差异。这些结果表明,SP能够通过与PsbP的互作改变PsbP蛋白的定位,并减少其在叶绿体中的积累量。为了了解RSV SP与PsbP互作的生物学意义,我们利用DNA1和BMV载体分别沉默本氏烟和水稻中的PsbP基因,将real-time RT-PCR证实PsbP基因表达显著下调的植株与PsbP过表达和表达下调的转基因植株一起进行病毒侵染效率测定实验。结果发现,与野生型本氏烟相比,RSV侵染效率在过表达PsbP的植株中明显下降,植株发病略微推迟,症状较轻,且Northern印迹检测到的病毒积累量较少；而在PsbP表达下调的植株中则刚好相反,RSV侵染效率显著提高,植株发病提前,症状加重,检测到的病毒积累量明显高于对照。表明PsbP蛋白的积累量会影响病毒的侵染效率。上述结果表明RSV SP蛋白可以通过与寄主PsbP蛋白的互作,改变PsbP蛋白的定位,并减少其在叶绿体中的积累量,从而破坏寄主光合作用,削弱寄主的防卫反应,提高病毒的侵染效率,进一步说明SP是RSV编码的致病相关蛋白。

论文目录

• 目录
• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1. 绪论
• 1.1 水稻条纹病毒研究进展
• 1.1.1 水稻条纹病毒的危害及其重要性
• 1.1.2 RSV的形态及基因组结构
• 1.1.3 RSV编码的蛋白及功能研究进展
• 1.1.3.1 RdRP
• 1.1.3.2 NS2
• 1.1.3.3 NSvc2
• 1.1.3.4 NS3
• 1.1.3.5 CP
• 1.1.3.6 SP
• 1.1.3.6.1 SP基因复制与表达策略
• 1.1.3.6.2 SP的血清学特性
• 1.1.3.6.3 SP同源性分析
• 1.1.3.6.4 SP在寄主植物内的积累
• 1.1.3.6.5 SP在介体昆虫内的积累
• 1.1.3.7 NSvc4
• 1.1.4 RSV的进化地位
• 1.2 植物RNA病毒与寄主叶绿体互作的生物学意义
• 1.2.1 复制组装
• 1.2.2 致病性和防卫反应
• 1.3 植物PsbP蛋白的研究进展
• 1.3.1 PsbP的进化演变
• 1.3.2 PsbP的功能
• 1.3.3 PsbP的结构
• 1.3.3.1 PsbP的结构域
• 1.3.3.2 PsbP的功能域
• 2 水稻条纹病毒编码的SP蛋白的功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 SP的PVX表达载体构建
• 2.1.3 侵染性克隆和病毒的接种
• 2.1.3.1 侵染性克隆的接种
• 2.1.3.2 本氏烟摩擦接种RSV
• 2.1.3.3 水稻喂虫传毒
• 2.1.3.4 病毒侵染效率的统计分析
• 2.1.3.5 ELISA检测病毒含量
• 2.1.4 植物总RNA的提取
• 2.1.5 Northern印迹分析
• 2.1.5.1 甲醛变性凝胶电泳
• 2.1.5.2 RNA转膜
• 2.1.5.3 杂交
• 2.1.6 烟草和水稻的遗传转化
• 2.1.6.1 遗传转化载体的构建
• 2.1.6.2 农杆菌的构建和培养
• 2.1.6.3 烟草和水稻的转化和生根
• 2.1.7 植物可溶性蛋白的提取
• 2.1.8 Western印迹分析
• 2.1.8.1 SDS-PAGE
• 2.1.8.2 电转移
• 2.1.8.3 Western印迹分析
• 2.1.9 GFP融合蛋白的瞬时表达
• 2.1.10 低温包埋及免疫金标记
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PVX异源病毒载体表达SP能够加重症状
• 2.2.2 在本氏烟和水稻中转入SP基因不能引起症状
• 2.2.3 转基因植物中SP蛋白的表达提高了RSV的侵染效率
• 2.3 讨论
• 3 RSV SP蛋白的寄主互作因子筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 酵母双杂交筛库试验
• 3.1.2.1 用于酵母双杂交筛库的诱饵构建
• 3.1.2.2 质粒转化酵母菌株Gold（LiAc法）
• 3.1.2.3 SP蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测
• 3.1.2.4 用融合法进行酵母双杂交筛库
• 3.1.2.5 酵母双杂交重组质粒的构建
• 3.1.2.6 酵母双杂交验证两种已知蛋白的互作
• 3.1.3 双分子荧光互补试验（BIFC）
• 3.1.3.1 载体构建
• 3.1.3.2 农杆菌浸润以及激光共聚焦观察BiFC结果
• 3.1.4 GST pull-down试验
• 3.1.4.1 蛋白表达载体构建
• 3.1.4.2 融合蛋白的诱导表达
• 3.1.4.3 表达产物的纯化
• 3.1.4.4 目的蛋白之间的GST pull-down
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 SP蛋白对酵母毒性及其自激活活性的检测
• 3.2.2 水稻中与SP互作的寄主因子筛选
• 3.2.3 酵母双杂交验证PsbP与SP蛋白的互作
• 3.2.4 BiFC验证PsbP与SP蛋白的互作
• 3.2.5 GST pull-down验证PsbP与SP蛋白的互作
• 3.3 讨论
• 4 SP蛋白与PsbP互作机理的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 本氏烟和水稻的遗传转化
• 4.1.3 Real-time RT-PCR分析
• 4.1.4 测定植物光合作用参数
• 4.1.5 常温包埋样品制备以及电镜观察细胞结构
• 4.1.6 共聚焦显微镜观察PsbP蛋白的亚细胞定位
• 4.1.7 低温包埋样品处理及免疫金标记
• 4.1.8 基于DNA1和BMV载体的基因沉默
• 4.1.8.1 沉默载体的构建
• 4.1.8.2 沉默载体的接种
• 4.1.9 RSV病毒的接种和侵染效率的统计
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 下调表达PsbP基因的植株生长迟缓
• 4.2.2 SP与PsbP的互作影响植株的光合作用
• 4.2.3 SP与PsbP的互作破坏细胞叶绿体结构
• 4.2.4 SP能够改变PsbP的亚细胞定位
• 4.2.5 SP能够减少PsbP在叶绿体中的积累量
• 4.2.6 PsbP蛋白的表达量对RSV侵染的影响
• 4.3 讨论
• 5 全文小结
• 附录Ⅰ BBW V-2 RNA2编码的抑制子鉴定及作用机理的研究
• 6.1 文献综述
• 6.1.1 RNA沉默概述
• 6.1.2 RNA沉默是抵御病毒入侵的固有机制
• 6.1.3 病毒编码的沉默抑制子
• 6.1.4 沉默抑制子的分子机理
• 6.1.4.1 抑制病毒的识别和siRNA的产生
• 6.1.4.2 阻止RISC的组装
• 6.1.4.3 抑制沉默信号的传导
• 6.1.5 沉默抑制子与症状诱导的关系
• 6.2 立项依据
• 6.3 材料与方法
• 6.3.1 材料
• 6.3.2 农杆菌瞬时表达沉默诱导体系的建立
• 6.3.2.1 瞬时表达载体的构建
• 6.3.2.2 瞬时表达载体在本氏烟上的表达
• 6.3.2.3 GFP荧光观察
• 6.3.3 小RNA的分离和杂交
• 6.3.3.1 小RNA的分离
• 6.3.3.2 小RNA的尿素变性电泳
• 6.3.3.3 小RNA的转膜
• 6.3.3.4 小RNA的预杂交和杂交
• 6.3.4 系统沉默体系的建立
• 6.3.5 沉默信号传导试验
• 6.3.6 沉默回复试验
• 6.3.7 致病性分析试验
• 6.3.8 凝胶阻滞试验
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 VP53、VP37、LCP能抑制由ssGFP诱发的局部沉默
• 6.4.2 BBWV-2编码的各蛋白不能抑制由dsGFP诱发的局部沉默
• 6.4.3 VP53、VP37、LCP可以抑制系统沉默
• 6.4.4 VP53、VP37、LCP蛋白可以抑制GFP沉默信号的传导
• 6.4.5 VP37和LCP能回复已建立的转录后基因沉默
• 6.4.6 VP53、VP37和LCP蛋白具有不同的GFP RNA结合活性
• 6.4.7 VP53、VP37和LCP蛋白的表达能加重PVX的症状
• 6.5 讨论
• 附录Ⅱ 参考文献
• 附录Ⅲ 本论文所用术语缩写词及中英文对照
• 附录Ⅳ 本论文所用病毒缩写及中英文对照
• 附录Ⅴ 常用缓冲液和培养基配方