论文摘要
目的在成骨细胞（ostelblast, OB）及破骨细胞（Osteoclast, OC）的表面均表达有胰岛素样生长因子1 （insulin like growth factor 1,IGF-I）的受体,IGF-I对这两种细胞也都具有激活作用。IGF-1在调节骨代谢平衡中具有重要作用,被认为是存在于RANKL/OPG系统之上,调节成骨细胞与破骨细胞相互作用的核心分子。为此,本文拟探讨不同浓度的rhIGF-I对成骨细胞和破骨细胞的直接作用,及对成骨细胞和破骨细胞相互作用的调节。方法1.利用50ng/ml的RANKL诱导小鼠破骨前体细胞系分化为成熟破骨细胞。TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶染色）鉴定。2.以50ng/ml rhIGF-I分别干预成细胞以及分化成熟的破骨细胞,干预时间分别为：6min、20min、60min; Western-blotting检测rhIGF-1R活化情况。3.分别加入0、2、4、6ug/ml的兔抗rhIGF-I IgG中和培养基中的rhIGF-I,利用Western-blotting进行抗体中和浓度的筛选。4.重新接种成骨细胞和破骨细胞,用0、10、50、100ng/ml的rhIGF-1分别干预成骨细胞、破骨细胞,12小时后终止培养并收集培基,之后实验分为三组：A组：rhIGF-1直接干预组。B组：条件培养基交互培养组：破骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基（OC conditioned medium after rhIGF-1 treatment, OCCM）;成骨细胞经rhIGF-1干预后的条件培养基（OB conditioned medium after rhIGF-1 treatment, OBCM）。滤过OCCM、OBCM后两细胞培基互换交互培养12h。C组：rhIGF-1中和后交互培养组：OCCM、OBCM中加入4g/ml的抗rhIGF-I IgG,中和后再用于交互培养12h。（1） ELISA检测各组OB上清液中RANKL、OPG及BGP含量。（2）实时荧光定量PCR检测各组OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平。结果1.50ng/ml的RANKL诱导培养8天后,RAW264.7出现TRAP阳性多核细胞。2. 50ng/ml rhIGF-I分别干预成骨细胞、破骨细胞6、20、60mmin后,Western-blotting检测随着rhIGF-1干预时间的延长磷酸化rMGF-1R的量逐渐增加,而未磷酸化rhIGF-1R逐渐减少。3.未加rhIGF-1干预空白对照组无磷酸化rhIGF-1R; rhIGF-1干预后可以检测到大量磷酸化rhIGF-1R; rhIGF-1干预后培基中加入2ug/ml抗体中和后可检测到少量磷酸化rhIGF-1R,而加入4、6ug/ml的抗体中和后未检测到磷酸化rhIGF-1R。同时随着中和抗体浓度的增加,非磷酸化IGF-IR也增加。4.（1）当rhIGF-1单独干预成骨细胞时,测定上清液中RANKL、OPG及BGP含量,结果显示不同浓度的IGF-1对成骨细胞合成RANKL、OPG及BGP无影响；而当用OCCM及抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时,发现三种细胞因子在上清液中的含量均在rhIGF-1初始干预浓度为10、50ng/mL时明显高于其他组,并以低剂量组——即rhIGF-1初始浓度为10ng/mL时最高。同时,当用抗体中和后的OCCM培养成骨细胞时,三种细胞因子在上清液中的表达在低剂量组明显高于OCCM培养的成骨细胞组。（2）实时荧光定量PCR检测结果显示rhIGF-1直接干预OB、OC时,OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平在不同剂量组与未加rhIGF-1干预的空白组之间无明显差别；而OCCM与抗体中和后OCCM培养的OB组及OBCM与抗体中和后OBCM培养的OC在rhIGF-1干预浓度为10ng/ml时j3gp、Opg、Rankl及Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表达水平显著高于空白组与其他剂量组,统计学分析表明前者与其它各组表达水平存在显著差异（p<0.05）。结论综合上述各项指标的检测结果显示,rhIGF-1直接干预成、破骨细胞时作用不明显；当有另一细胞参与后,各项检测指标的变化均非常显著,以低剂量组最为明显,但不是剂量依赖性。鉴于rhIGF-1已经被证实有显著的体内促成骨活性,因此本研究推测rhIGF-1在对成骨细胞的刺激上可能首先作用于破骨细胞,引起破骨细胞及其活动微环境的改变,进而影响到成骨细胞的生长和功能；同理对破骨细胞也是一样,要先作用于成骨细胞引起成骨细胞及其活动微环境的改变,进而影响到破骨细胞的生长和功能。
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标签：重组人胰岛素样生长因子论文; 成骨细胞论文; 破骨细胞论文; 实时荧光定量论文;