平邑甜茶MhCDPK基因克隆、表达、载体构建及其再生体系的建立

论文摘要

钙依赖蛋白激酶（CDPKs）是一种钙依赖的Ser/Thr型蛋白激酶,在植物生长发育和逆境信号传递中起重要作用;平邑甜茶（Malus hupehensis （Pamp） Rehd. var pinyiensis Jiang, PYTC）是优良的苹果砧木。本文从平邑甜茶叶片中克隆了MhCDPK全长,分析了其序列与编码蛋白,研究了胁迫下MhCDPK表达,并成功地建立了平邑甜茶再生体系,主要结果如下:1.根据已知植物CDPK基因序列设计引物,利用RT-PCR获得了平邑甜茶CDPK基因,命名为MhCDPK。GenBank注册号为EF519915。序列分析表明,MhCDPK cDNA全长1999bp,编码区长1701bp,编码566个氨基酸,分子量和等电点分别为62.9kD和5.26。MhCDPK编码的蛋白具有典型的CDPK结构特征,包括N端可变区（1-108）、激酶区（109-366）、连接区（367-402）和调节区（403-566）。推测的MhCDPK氨基酸序列与植物中的许多CDPKs具有很高的同源性。2.实时荧光定量PCR表明,NaCl、干旱以及重金属等胁迫均能提高MhCDPK基因表达量。3.构建了MhCDPK正义与反义表达载体并转化农杆菌LB4404,对烟草叶片进行侵染,获得了转反义基因烟草植株。构建了pBI121-gMhCDPK -GFP表达载体并转化农杆菌EHA105,侵染洋葱表皮使其表达,在荧光显微镜下观察,MhCDPK定位于细胞质内。4.幼苗茎段为离体培养合适的外植体;在培养基MS+0.5mg·L-1BA +0.2mg·L-1ZT+0.1mg·L-1NAA中增殖倍数达15.6倍;培养基1/2MS+IBA0.5 mg·L-1+NAA0.3 mg·L-1中生根率达85.6%,生根条数达15.5条。5. 6-BA、ZT、NAA和暗培养均有利于叶片不定芽的分化;以MS+ 6.0mg·L-1 BA+0.5mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1ZT + 6.0 mg·L-1 SNP为培养基,暗培养15d,叶片不定芽分化效果最好,再生率达67.8%。6. SNP对平邑甜茶继代增殖以及不定芽和根系分化影响显著,并呈明显剂量效应。SNP对第1代继代组培苗的增殖倍数影响最大,20μmol·L-1 SNP增殖倍数最高达11.26倍;2030μmol·L-1 SNP能显著地增强子叶与继代组培苗叶片不定芽的再生能力;75μmol·L-1 SNP对组培苗生根效果最好。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 钙依赖蛋白激酶（CDPK）研究进展
• 1.1.1 CDPK 序列结构和生化特性
• 1.1.2 CDPK 活性调控及其在植物信号转导中的作用
• 1.1.3 CDPK 底物以及专一性
• 1.1.4 高等植物CDPKs 的基因克隆
• 1.2 平邑甜茶离体培养研究进展
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 MhCDPK 的克隆与测序
• 2.2.2 MhCDPK 正义表达载体的构建
• 2.2.3 MhCDPK 反义表达载体的构建
• 2.2.4 PBI121-gMhCDPK-GFP 表达载体的构建
• 2.2.5 农杆菌介导的烟草的转化
• 2.2.6 转基因烟草的分子生物学鉴定
• 2.2.7 实时定量 PCR 分析
• 2.2.8 平邑甜茶茎段的离体培养
• 2.2.9 平邑甜茶叶片不定芽再生体系的建立
• 2.2.10 平邑甜茶子叶不定芽再生体系的建立
• 2.2.11 NO 对平邑甜茶组培苗增殖和再生的影响
• 3. 结果与分析
• 3.1 MhCDPK 的克隆与序列分析
• 3.1.1 MhCDPK 的分离
• 3.1.2 MhCDPK 的序列分析
• 3.1.3 MhCDPK 与不同来源的CDPKs 的聚类分析
• 3.2 MhCDPK 编码蛋白的特性分析
• 3.2.1 MhCDPK 编码蛋白的氨基酸序列分析
• 3.2.2 MhCDPK 编码的蛋白保守结构域分析
• 3.2.3 MhCDPK 编码的蛋白疏水性分析
• 3.3 平邑甜茶 MhCDPK 对胁迫的响应
• 3.3.1 PEG 胁迫下MhCDPK 的表达特性
• 3.3.2 NaCl 胁迫下MhCDPK 的表达特性
• 3.3.3 镉胁迫下MhCDPK 的表达特性
• 3.4 MhCDPK 表达载体的构建
• 3.4.1 正义表达载体pBI121-MhCDPK 的构建
• 3.4.2 反义表达载体pBI121-antiMhCDPK 的构建
• 3.4.3 pBI121-gMhCDPK-GFP 表达载体的构建
• 3.4.4 MhCDPK 编码蛋白的定位分析
• 3.5 平邑甜茶再生体系的建立
• 3.5.1 平邑甜茶茎段的离体培养
• 3.5.2 平邑甜茶叶片不定芽再生体系的建立
• 3.5.3 平邑甜茶子叶不定芽再生体系的建立
• 3.5.4 NO 对平邑甜茶组培苗增殖和再生的影响
• 4. 讨论
• 4.1 MhCDPK 具有CDPKs 的所有典型特征
• 4.2 MhCDPK 表达载体的构建
• 4.3 平邑甜茶再生体系的建立
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况