水稻种胚脂氧合酶基因OsLOX2的克隆与功能分析

论文摘要

延缓陈化是稻谷安全储藏的重要任务。脂肪过氧化是稻谷陈化变质的重要原因,而脂氧合酶是脂肪过氧化的关键酶,所以对水稻种胚脂氧合酶进行研究对于种子耐储藏具有重大意义。研究表明,水稻种胚脂氧合酶家族中脂氧合酶-3（OsLOX3）被认为与稻谷的耐贮藏相关,脂氧合酶-1（OsLOX1）与幼苗抗虫性相关,而脂氧合酶-2（OsLOX2）的生理功能目前仍不清楚。本研究通过克隆水稻种胚OsLOX2基因,旨在通过该基因的一系列功能分析,探讨脂氧合酶-2对种子老化和萌发的影响,为开发耐储藏水稻新品系奠定理论基础。时空表达分析表明,OsLOX2基因在开花后7天的成熟植株的不同组织中均有表达,其中根与茎中表达量最高,穗较低,叶片中极低；开花后种胚开始形成,自开花后6天至21天内,每3天取种胚进行表达分析,发现OsLOX2的表达量呈先上升后下降的趋势,在开花后第18天达到峰值；成熟种子浸水后种胚开始萌动再发育,OsLOX2基因在萌动早期的胚中表达量显著增高,4天时的幼叶及幼根中持续高表达,随后迅速降低,直至12天时表达量已趋于本底水平。综合这些结果表明,OsLOX2基因在种胚的形成及萌动后再发育初期阶段均特异性地表达,该基因与这两个发育阶段中至关重要。为了进一步分析OsLOX2基因的功能,我们从萌动的日本晴种胚中克隆OsLOX2的全长cDNA,并由此展开功能分析。利用35S::GFP:OsLOX2融合表达载体在水稻原生质体中的瞬时表达确定OsLOX2蛋白在细胞质中起作用。利用T7pro::His:OsLOX2:His载体原核表达并纯化获得OsLOX2重组蛋白,酶活性测定结果显示OsLOX2对底物亚油酸的酶活显著高于亚麻酸,对温度具有较宽的适应范围（20-50℃）。此外,利用农杆菌介导获得了OsLOX2基因过表达及RNA干扰的转基因纯合株系,结合从CIRAD突变体库索取到日本晴Tos17插入突变体材料CU313865,综合分析了基因表达水平与种子萌发及老化的关系。结果显示,过表达转基因株系相比于对照受体材料的OsLOX2基因的表达量显著增加,表现出种子萌发速率提高,老化加快（老化处理后种子的发芽率下降）；反之,在OsLOX2基因表达降低的RNA干扰株系及Tos17突变体中,均表现出较对照低的发芽速率；有趣的是,OsLOX2基因表达减弱的株系老化减缓,表现在老化处理后发芽率较对照高,而当OsLOX2基因表达过低时,老化处理后发芽率反而降低,即造成萌发障碍。说明OsLOX2基因能够促进萌发,加速老化,但在种子萌发过程中必不可少。适量降低该基因的表达将有助于在不阻碍种子萌发的前提下延长种子寿命,增加耐储藏性,在种子生产和储存上具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 植物脂氧合酶蛋白的特性
• 1.1 分布
• 1.2 分类
• 1.3 结构特征和催化位点
• 1.4 LOX酶活的测定方法
• 1.5 酶学特性
• 1.6 催化机理
• 2 植物脂氧合酶生理功能
• 2.1 LOX途径
• 2.2 植物脂氧合酶生理功能
• 3 种子萌发与脂氧合酶
• 3.1 自然条件下种子萌发
• 3.2 老化条件下种子萌发
• 4 水稻种胚脂氧合酶的研究进展
• 5 展望
• 6 本研究的目的意义与内容
• 第二章 水稻成熟和萌发过程中种子脂氧合酶OsLOX2的表达谱
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 OsLOX2基因结构与序列分析
• 2.2 OsLOX2 Real-Time PCR引物的设计与有效性确认
• 2.3 OsLOX2在成熟植株中的组织表达谱
• 2.4 OsLOX2在种胚发育进程中的表达变化
• 2.5 OsLOX2在种子萌发进程中的表达变化
• 3 讨论
• 第三章 水稻种胚脂氧合酶基因OsLOX2的克隆和亚细胞定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 引物设计及cDNA基因片段的克隆
• 2.2 细胞定位预测
• 2.3 细胞定位
• 3 讨论
• 第四章 水稻种胚脂氧合酶OsLOX2的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.2 SDS-PAGE分析
• 2.3 表达载体融合蛋白的活性测定
• 3 讨论
• 第五章 水稻种胚脂氧合酶OsLOX2基因的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 过表达载体pPZP-LOX2的构建
• 2.2 人工microRNA干扰载体pPZP-L2的构建
• 2.3 发卡结构RNAi干扰载体LH-535的构建
• 2.4 日本晴Tos17插入突变体lox2（Tos17）的鉴定
• 2.5 转基因植株的鉴定
• 2.6 荧光定量PCR检测纯合转基因植株和插入突变体中OsLOX2的表达量
• 2.7 OsLOX2促进种子萌发
• 2.8 OsLOX2加速种子老化,适度降低OsLOX2表达可以延长种子储藏时间
• 3 讨论
• 第六章 全文总结及讨论
• 参考文献
• 附录
• 1 总DNA的提取（SDS法）及检测
• 1.1 溶液配制
• 1.2 DNA提取步骤
• 2 植物总RNA的提取
• 2.1 植物总RNA提取试剂盒提取水稻组织RNA
• 2.2 Trizol法提取水稻组织RNA
• 3 DNA和RNA的检测
• 4 植物愈伤的转化、抗性愈伤的筛选和植株再生
• 5 配方
• 6 载体图
• 致谢