蝗虫肠道菌群结构的分子生态学研究

论文摘要

蝗虫是世界性的农业害虫,在我国分布范围广、种群数量大。20世纪90年代以来,受异常气候及生态环境恶化等因素的影响,我国蝗虫的发生逐年加重,以东亚飞蝗为主的蝗灾发生面积扩大,暴发频率提高,对我国农业生产构成严重威胁。东亚飞蝗（Locust migratoria manilensis（Meyen））属直翅目（Orthoptera）、斑翅蝗科（Oedipodidae）、飞蝗属（Locusta Linnaeus）,是蝗虫类群中为害较大的一种。昆虫肠道内定植着大量的微生物,这些微生物对宿主有着各种各样的作用,可为宿主提供营养物质、参与解毒、协助消化;还有一些昆虫的肠道微生物与生物信息素的分泌有关。本文通过研究分析东亚飞蝗的肠道菌群结构,为探讨蝗虫肠道微生物对蝗虫的生理功能和生态学意义奠定基础,为进一步了解蝗虫与其共生菌的协同进化、物种进化途径提供新的认识,为蝗虫的防治提供新的思路和途径。本研究首先采用Bead beating法（B法）和QIAamp DNA stool mini kit法（Q法）提取蝗虫肠道微生物总DNA,并对两种方法所提取DNA的得率、完整性以及16SrRNA基因扩增产物的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）图谱进行综合比较。结果表明,B法提取DNA的得率显著高于Q法,而Q法提取DNA片段更完整。PCR-DGGE检测肠道微生物多样性结果显示,Q法提取DNA所代表的微生物群落多样性略高于B法,但统计学检验表明用这两种方法检测到的蝗虫肠道微生物多样性无显著差异,因此,两种方法均适用于蝗虫肠道微生物总DNA的提取。在后续研究过程中,均采用B法对蝗虫肠道微生物总DNA进行提取。本研究运用16S rRNA基因片段序列分析结合PCR-DGGE分析的技术比较研究了东亚飞蝗成虫肠道不同肠段,前肠、中肠和后肠微生物群落结构的多态性。PCR-DGGE图谱的条带数目的统计学分析结果及PCR-DGGE图谱的主成分分析（Principal Components Analysis,PCA）结果显示,前肠具有较高的微生物群落多样性;前肠微生物群落结构显著区别于中肠和后肠,中肠与后肠的微生物群落结构相似。PCR-DGGE图谱显示,中肠与后肠内定植有稳定的优势微生物类群,而与前肠有所不同。将东亚飞蝗前肠、中肠和后肠的微生物群落结构的PCR-DGGE图谱中优势条带进行割胶测序。在GenBank中进行序列比对后发现,东亚飞蝗肠道中优势微生物的类型主要为肠球菌属、克雷伯氏菌属、乳球菌属和魏斯氏菌属。本研究还运用同样的分析技术比较了东亚飞蝗前肠、中肠和后肠每个肠段水平上雌雄虫体肠道内微生物群落结构的差异。结果表明:雌雄虫体前肠的微生物群落结构没有显著的差别;到中肠,开始出现差异的趋势;到后肠,雌雄个体的微生物群落结构呈现出明显差异。对于PCR-DGGE方法检测出的雌雄虫体后肠微生物组成上的差异,本研究还运用了末端标记-限制性片段长度多态性（T-RFLP）方法进行了验证。以雌雄虫体后肠微生物总DNA为模板,扩增带有荧光标记的16S rRNA基因片段,酶切后进行T-RFLP检测以及PCA分析,结果同样表明,在后肠,微生物群落结构存在性别上的差异。由此推断,后肠微生物与宿主的关系更近。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 昆虫肠道微生物研究概况
• 1.1.1 昆虫肠道共生菌分布的研究
• 1.1.2 昆虫肠道共生菌功能的研究
• 1.1.3 昆虫肠道微生物多样性的研究
• 1.2 蝗虫肠道微生物研究概况
• 1.2.1 蝗虫肠道微生物群落结构多样性研究
• 1.2.2 蝗虫肠道微生物功能的研究
• 1.3 肠道微生物研究方法
• 1.3.1 依赖培养的分析方法
• 1.3.2 不依赖培养的分子分析方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 基于RCR-DGGE指纹图谱的分子生态学研究技术建立分析蝗虫肠道微生物群落结构的DNA提取方法
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试东亚飞蝗的采集及饲养
• 2.1.2 两种肠道微生物总DNA的提取方法
• 2.1.3 DNA检测及稀释
• 2.1.4 肠道细菌16S rRNA基因的扩增
• 2.1.5 肠道细菌组成的DGGE指纹图谱
• 2.1.6 变性梯度凝胶电泳的数字化分析
• 2.1.7 肠道微生物总DNA得率和群落结构的统计学分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 Q法与B法提取DNA质量的比较
• 2.2.2 PCR扩增结果
• 2.2.3 DGGE电泳图谱
• 2.3 讨论
• 第三章 天津东亚飞蝗不同肠段微生物群落结构分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 供试样本
• 3.1.2 蝗虫肠道微生物总DNA的提取
• 3.1.3 肠道微生物优势细菌的扩增
• 3.1.4 不同肠段中细菌组成的DGGE指纹图谱
• 3.1.5 变性梯度凝胶电泳的数字化分析及群落结构的统计学分析
• 3.1.6 多变量统计分析技术
• 3.1.7 PCR-DGGE凝胶回收与测序
• 3.2 结果
• 3.2.1 东亚飞蝗不同肠段微生物总DNA的提取质量比较
• 3.2.2 东亚飞蝗不同肠段微生物16S rRNA基因——V3片段的扩增
• 3.2.3 东亚飞蝗不同肠段微生物群落结构变化规律研究
• 3.3 讨论
• 第四章 天津东亚飞蝗不同性别个体肠道微生物群落结构的比较研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 供试样本
• 4.1.2 蝗虫肠道微生物总DNA的提取
• 4.1.3 肠道微生物优势细菌的扩增
• 4.1.4 不同肠段中细菌组成的DGGE指纹图谱
• 4.1.5 变性梯度凝胶电泳的数字化分析及群落结构的统计学分析
• 4.1.6 多变量统计分析
• 4.1.7 PCR-DGGE凝胶回收与测序
• 4.1.8 雌雄个体后肠样本的T-RFLP
• 4.2 结果
• 4.2.1 不同性别东亚飞蝗在各肠段上微生物群落结构DGGE分析
• 4.2.2 DGGE图谱中优势条带割胶回收及测序
• 4.2.3 不同性别东亚飞蝗后肠微生物群落结构T-RFLP分析
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢
• 个人简历