兔生长激素的表达、纯化和鉴定

论文摘要

人生长激素作为一种蛋白质药物用于治疗生长激素缺乏等症在临床应用多年，关于生长激素适应症的研究始终没有间断。因此建立一个合适的动物模型对生长激素的应用研究至关重要。兔就是一种研究生长激素功能的较理想模型。因此，本文利用大肠杆菌表达、复性、纯化获得了兔成长激素并且对其进行了鉴定。从而首次获得了成熟兔生长激素。将插入兔生长激素基因片段的pET11a和pET32a融合型表达载体，分别转化到大肠杆菌中，经IPTG诱导，成功表达了融合蛋白MEAE-rabGH和Trx-D4KrabGH。两种融合蛋白均以包涵体的形式表达，表达水平分别为47mg/L·OD和122mg/L·OD。尝试低温培养和降低诱导IPTG浓度以期获得可溶性表达，但未获得预期结果。分离包涵体后，优化了包涵体的溶解条件和复性条件。用优化条件获得的复性蛋白经Q Sepharose Fast Flow初步纯化后，优化了蛋白酶切条件。用优化酶切条件酶切得到的产物经Sourse 30S精细纯化得到了纯度大于95%的成熟兔生长激素。Trx-D4K-rabGH策略和MEAE-rabGH策略的纯化收率分别为5.8%和8.9%。利用基质辅助激光电离解吸附-飞行时间质谱测定了兔生长激素完整蛋白分子量为21771Da，与理论值吻合。胰蛋白酶水解后，经质谱分析得到了兔生长激素胰蛋白酶切指纹图谱，分析确定了二硫键组合为Cys52-Cys163和Cys180-Cys188，与预期吻合。细胞学实验表明纯化的兔生长激素有活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 生长激素研究综述
• 1.1 动物激素简介
• 1.2 生长激素
• 1.2.1 生长激素简介
• 1.2.2 生长激素的研究历史
• 1.2.3 生长激素的基本结构
• 1.2.4 生长激素的分泌
• 1.2.5 生长激素的作用机理
• 1.2.6 生长激素的生理功能
• 1.2.7 生长激素释放肽的研究进展
• 1.2.8 生长激素受体的研究进展
• 1.3 生长激素的临床应用进展
• 1.3.1 儿科应用
• 1.3.2 内科应用
• 1.3.3 外科应用
• 1.4 兔生长激素和兔生长激素受体的研究
• 第二章 Trx-rabGH 和MEAE-rabGH 在大肠杆菌中的表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和载体
• 2.1.2 工具酶、分子量参照物及主要试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 兔生长激素在大肠杆菌BL21（DE3）中的初步表达
• 2.2.1 表达型重组质粒的宿主菌转化和表达
• 2.2.2 诱导后菌体的处理
• 2.2.3 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达结果
• 2.2.4 融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的优化
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 诱导表达产物的SDS-PAGE 鉴定
• 2.3.2 表达条件优化
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 融合蛋白的复性、纯化和鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 工具酶、分子量参照物及主要试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 大肠杆菌菌体的裂解、包涵体的分离洗涤
• 3.2.2 复性条件的优化
• 3.2.3 复性后融合蛋白的纯化
• 3.2.4 融合蛋白的初纯化后酶切
• 3.2.5 酶切后纯化
• 3.2.6 利用MALDI-TOF MS 鉴定纯化后的rabGH
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 融合蛋白包涵体的复性
• 3.3.2 复性蛋白的初步纯化
• 3.3.3 融合蛋白的酶切
• 3.3.4 酶切产物的精纯化
• 3.3.5 MALDI-TOF MS 鉴定rabGH
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 将来工作的重点
• 参考文献
• 致谢