论文摘要
研究背景:（1）宫颈癌（cervical cancer ,CC）是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤。其发生发展与多种因素有关,其中人乳头瘤病毒（human papillomavirus , HPV）感染和端粒酶（Telomerase）的激活是两个最为主要的环节。端粒酶抑制因子X1（ThePin2/TRF1-Interacting Protein X1,PinX1）是近年发现的强效端粒酶抑制剂,可与端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）直接结合并抑制其活性从而发挥抑制端粒酶的作用。PinX1位于容易发生杂和性缺失（loss of heterozygosity,LOH）且基因不稳定性程度较高的人染色体8p23,已有研究表明,PinX1基因在肝癌,遗传性前列腺癌,成神经管细胞瘤等人体肿瘤中均存在变异,但该基因在宫颈癌中的变异情况如何目前尚不清楚。（2）致病性HPV具有很多亚型,其中HPV16,18被公认为是最重要的高危亚型。高危型人乳头瘤病毒DNA（HR-HPV DNA）整合到宿主基因组后,病毒原癌蛋白E6、E7基因表达,导致宿主细胞转化与增殖。近年研究表明,原癌蛋白E6可在早期永生化阶段激活端粒酶,同时在HPV阳性的宫颈癌细胞中,E6蛋白可与P53结合并通过泛素化途径促使P53降解。由此可见, HPV16E6与端粒酶活化呈正相关,与P53蛋白水平呈负相关。既然PinX1是端粒酶的强效抑制因子,那么E6有无可能亦通过对PinX1的抑制以实现对端粒酶的激活目前尚未见报道。P53与PinX1于宫颈中均为低表达,且有报道表明PinX1上游正性调控序列存在P53结合位点。结合上述知识,我们提出了“HPV16E6原癌蛋白很有可能通过P53蛋白间接下调PinX1基因的表达,从而实现对端粒酶活性的调控”这一假设。弄清这些问题,将进一步更加全面的揭示HPV诱发宫颈癌发生发展过程中端粒酶活性的调节机制,并为寻找调控端粒酶活性的潜在新靶点提供新的理论依据。研究目的:（1）探讨端粒酶抑制因子PinX1在宫颈癌中的变异情况,为阐明PinX1基因变异与宫颈癌的关系提供科学依据。（2）探讨HPV16E6对PinX1表达的调控作用及其机制,为更加全面的解读HPV16E6促进端粒酶活性的机制提供新的理论资料。研究方法:（1）采用3种宫颈癌细胞系（Hela/C-33A/CaSki）、28例正常宫颈组织及52例宫颈癌组织标本。提取其基因组DNA为模板,PCR扩增PinX1基因全部7个外显子及其部分侧翼序列,PCR产物直接测序后经SPSS统计学软件进行数据分析,从而检测PinX1基因的变异情况。（2）构建pEGFP-HPV16E6真核表达载体及针对HPV16E6的Si-RNA,分别转入宫颈癌细胞系C-33A（无HPV感染）及CaSki（HPV16感染）,获得HPV16E6原癌蛋白过表达及沉默的细胞模型。在这两种细胞模型的基础上,加入P53特异性抑制剂Pifithrin-α（PFT-α）处理,通过RT-PCR、Real-time PCR、Western Blot等方法检测PinX1、P53分子的表达水平,探讨HPV16E6对PinX1表达水平的影响,并且该种影响是否可能通过P53发挥作用。进一步借助Luc报告基因检测、EMSA、ChIP等技术,验证P53在PinX1基因5’调控区中的具体结合位点,明确PinX1是P53的一个新的靶基因,从而阐明P53在转录水平上促进PinX1表达的具体分子机制。研究结果:（1）于宫颈癌细胞系中发现3个突变位点,于52例宫颈癌组织中发现5个变异位点,其中位于第7外显子的Ser254Cys（23.1%）及位于第2内含子的IVS2+18 G→A（51.9%）变异率与正常宫颈组织相比有显著差异（P<0.05）,位于第2内含子的1个变异位点IVS2+64 C→A（9.3%）为首次报道。（2）在HPV16E6过表达及沉默的细胞模型中验证了HPV16E6的感染可在mRNA及蛋白水平下调PinX1及P53的表达水平。同时明确了P53可以与PinX1基因5’调控区直接结合,明确了PinX1是P53新的靶基因。结论:（1）宫颈癌中存在PinX1基因的变异,对其变异位点的分析,可为阐明PinX1基因的变异与宫颈癌的关系提供新的科学依据,同时为宫颈癌的诊断、防治和个体化诊疗提供潜在的新靶标。（2）发现了HPV16E6的感染可在mRNA及蛋白水平下调PinX1分子的表达,同时验证了宫颈癌中PinX1作为下游分子接受上游转录因子P53调控的可能性,明确了PinX1是P53的一个新的靶基因,从而初步阐明了HPV16E6下调PinX1表达的分子机制。对PinX1表达调控的研究,可更加全面的阐明HPV16E6与端粒酶的关系,从而为更加深入的揭示宫颈癌发生发展过程中端粒酶活性的调节机制提供新的科学依据。