供体骨髓间充质干细胞输注对大鼠移植肝的免疫保护作用的研究

论文摘要

第一部分大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反应模型的建立目的：建立大鼠原位肝移植模型及稳定的近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型。方法：SD大鼠为供、受体的同种同基因肝移植20只（SD-SD组）,DA、Lewis分别为供、受体的同种异基因肝移植20只（DA-Lewis组）。采用改良的Kamada’s“二袖套法”进行大鼠原位肝移植,充分暴露第一肝门,不翻动肝脏先行门静脉灌注。“双线牵引法”行门静脉、肝下下腔静脉袖套吻合。建立近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型,检测肝功能,观察生存期,根据Banff分级评分方案来评价排斥反应的强度。结果：供体手术时间（42.2±4.5）min,受体手术时间（45.5±3.5）min,无肝期（15.0±2.1）min,手术成功率90.0%,1周存活率85.0%。SD-SD组手术成功19只,术后并发症死亡1例,受体平均存活时间55.75±3.20天,术后第7天肝功能基本正常,肝组织病理无明显变化,RAI评分1.75±0.70分。DA-Lewis组手术成功17只,术后并发症死亡1例,受体平均存活时间10.25±2.57天,术后第7天ALT,AST及TBIL水平较前者明显升高,差异有显著性,RAI评分为7.85±0.72,属于严重急性排斥反应表现。结论：（1）采用改良的Kamada’s“二袖套法”,改进肝上、下腔静脉重建及肝脏灌注方法,“双线牵引法”改良门静脉套管技术,成功建立大鼠原位肝移植模型；（2）DA→Lewis同种异基因ROLT是稳定的肝移植急性排斥反应模型。第二部分供体骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定目的：体外分离培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并进行鉴定。方法：密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养MSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,流式细胞仪检测细胞免疫表型及体外诱导成骨、脂肪和软骨细胞分化。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样；流式细胞仪检测结果为：CD44、CD29阳性、CD34、CD44阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞；具有多向分化潜能。结论：（1）本实验采用密度梯度离心结合贴壁法的方法,从大鼠骨髓中分离到MSCs;（2）通过形态学、免疫学表型及多向分化潜能证实了其MSCs特征。第三部分体外试验中间充质干细胞免疫抑制功能的研究目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在混和淋巴细胞反应（MLC）中对同种异基因T淋巴细胞免疫应答反应的影响,并初步探讨其作用机制。方法：建立MSCs和同种异基因淋巴细胞共培养体系,反应体系总量200μl。以DA大鼠的脾T淋巴细胞为刺激细胞,以Lewis大鼠的脾T淋巴细胞为反应细胞,分为4组。所有组别按1：1比例加入刺激细胞和反应细胞,细胞数为1x105/50μl。A组：对照组；B组：加入1x103/1μlDA大鼠的MSCs;C组：加入1×104/10μlMSCs;D组：加入1×105/100μl MSCs。混合培养5天,加入3H-TdR1微居,以液闪测定仪测定各组的CPM值；混合培养7天,上清ELISA法检测IL-2、IL-4、IL-10和IFN-y的含量。结果：MSCs可以抑制MLC体系中T淋巴细胞增殖,并呈现出剂量依赖关系；IL-2和IFN-y的含量在对照组中最高,随MSCs数量的增加而降低（P<0.05）,差异有显著性；IL-4和IL-10的含量则相反（P<0.05）,差异有显著性。结论：（1）MSCs可抑制Thl细胞分泌IL-2、IFN-y，增加Th2细胞分泌IL-4. IL-10,且呈MSCs数量依赖性；（2）MSCs可以抑制混合淋巴细胞反应中T细胞的增殖,这种抑制作用可能与调节Th1/Th2反应平衡相关。第四部分MSCs对大鼠肝移植急性排斥发应的影响目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）对肝移植急性排斥反应的抑制作用及探讨其相关机制。方法：供体选用雄性DA大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’s“二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成6个组：A组为假手术组（n=6）；B组为对照组（n=12）；C组为雷帕霉素（RAPA）组（n=12）,手术当天口服RAPA（2mg/kg/d）,连续14天；D组为MSCs组（n=12）,经门静脉注入lml MSCs悬液；E组为MSCs+RAPA组（n=12）,同上,同时手术当天口服RAPA（2mg/kg/d）,连续14天。B,C,D及E组分成2个亚组（n=6）,一个亚组观察大鼠移植后生存期,另一亚组分别于移植后7d处死大鼠,检测血清ALT, AST, TBIL水平；肝组织行HE染色,进行病理组织学检查并进行评分（根据Banff分级评分方案）；ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-y的含量；流式细胞仪检测脾脏组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。结果：和D组比较, B、C组生存期缩短（P<0.05）,而E组明显延长（P<0.05）；移植术后7d,B、C组血清ALT, AST, TBIL水平升高（P<0.05）,E组降低（P<0.05）；B、C组排斥发应活动指数（RAI）明显升高（P<0.05）,而E组降低（P<0.05）,差异均有显著性。与B、C组比较,D、E组受体血清中IL-2和IFN-γ的含量降低（P<0.05）,E组与D组相比更明显（P<0.05）；IL-10的含量则相反,差异均有显著性；IL-4水平在各组未见显著性差异。受体脾组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,C、D、E组较B组均增高（P<0.05）；D、E组较C组均增高（P<0.05）；E组较D组增高（P<0.05）,差异均有显著性。结论：（1）MSCs可以改善肝功能、降低移植肝排斥反应病理学评分（RAI）,延长其生存期；（2）MSCs可以改变T细胞亚群细胞因子的分泌量及改变CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,减轻肝移植急性排斥反应；（3）RAPA对MSCs抑制肝移植急性排斥反应可能起协同作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反应模型的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 附图
• 第二部分 供体骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 附图
• 第三部分 体外试验中间充质干细胞免疫抑制功能的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 附图
• 第四部分 MSCs对大鼠肝移植急性排斥反应的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 5 附图
• 研究总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间的主要研究成果