内皮抑素在肺腺癌中的表达及其对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响

论文摘要

研究背景和目的肺癌是一个世界范围内的严重危害人们健康的恶性肿瘤,已居各类恶性肿瘤死亡率首位。特别是肺腺癌,早期症状不明显,缺少有效的早期、无创检查方法,并且具有高侵袭性、高转移性的生物学特性,早期即可发生血液和淋巴转移,因而研究肺腺癌的血管和淋巴管生成及转移的相关分子机制,寻找阻断其血液和淋巴转移的新方法,具有非常重要的意义。传统的治疗包括手术、化疗和放疗等均不能很好的组织肿瘤的转移,随着对肿瘤认识的逐渐深入,现已知道实体肿瘤的发生、生长、浸润以及转移均依赖于新生血管的形成,因此抗血管生成治疗如血管抑素、内皮抑素等的发现和应用为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。然而,淋巴管系统与血管系统是一个互为交通的网络结构,肿瘤细胞可在两个管道系统之间自由进出,单纯阻断血管途径并不能很好地控制肿瘤细胞远处转移,而且肿瘤血管生成的过程也需要淋巴管参与,因此近年来关于肿瘤淋巴管生成的研究越来越得到重视。内皮抑素是0’Reilly等首先从培养的鼠内皮细胞瘤上清液中发现的血管生成抑制因子,它能特异性抑制血管内皮细胞增殖并明显地抑制肿瘤的生长和转移。体外实验证实,endostatin对淋巴管内皮细胞增殖亦具有明显的抑制作用,而且呈剂量依赖性,而endostatin是否具有抑制肿瘤淋巴管生成进而抑制肿瘤淋巴转移的作用,目前关于此方面的研究国内外均少见。endostar是在endostatin上添加了9个氨基酸的新型重组endostatin,稳定性高、纯度高,为研究endostatin抗淋巴管生成的研究提供了简便易行的途径。本课题首先检测了人肺腺癌endostatin表达和微淋巴管密度（MLVD）,研究endostatin在肺腺癌中的表达及其与淋巴管生成和淋巴转移的相关性；然后建立Lewis肺癌小鼠模型,对重组内皮抑素endostar对Lewis肺癌生长及淋巴管生成的影响进行了研究,以期为今后endostatin应用于肺癌的抗淋巴转移治疗提供一定的理论依据。材料和方法第一部分人肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系60例肺癌组织标本取自山东大学第二医院胸外科自2006年3月-2009年5月接受手术治疗的病人,所有病人术前均未接受过放疗或化疗等治疗,术后病理均证实为肺腺癌。其中：男33例,女27例；年龄45-69岁。60例标本中,低分化腺癌29例,高中分化腺癌31例；中心型肺癌32例,周围型肺癌28例。根据UICC1997年肺癌P-TNM分期标准,Ⅰ期+Ⅱ期25例,Ⅲ期+Ⅳ期35例。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接（Streptavidin-peroxidase, S-P）免疫组织化学方法检测肺癌组织endostatin蛋白的表达及肺癌组织微淋巴管密度（Micro lymphatic vessel density, MLVD）,一抗endostatin单抗购自美国Santa Cruz公司,D2-40抗体购自英国Abeam公司,S-P试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。endostatin根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和来判断。染色强度积分：不染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分；染色面积：无细胞染色为0分,<25%细胞染色为1分,25%-50%细胞染色为2分,>50%细胞染色为3分；两者积分之和>2,则为表达阳性,≤2则为表达阴性。D2-40阳性染色的内皮细胞计为淋巴管,先在低倍镜（100倍）下寻找阳性脉管密集区,然后换高倍镜（400倍）选取5个视野计数,取其平均值作为每例的MLVD。第二部分重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响复苏Lewis肺癌瘤种,种植于C57BL/6小鼠右腋下,传至第3代,将瘤细胞取出,研磨,筛网过滤,调细胞浓度为5×106/L,进行尾静脉注射,每只小鼠注射约1×106个细胞。肿瘤接种8天后,随机将小鼠分为两组,每组20只。对照组接受生理盐水皮下注射,0.2ml/（天·只）；实验组接受重组内皮抑素endostar皮下注射,500μg/（天·只）；连续注射15天。接种瘤细胞后开始观察,观察期为6周。观察期结束后处死小鼠,剖胸取出肺脏,并收集淋巴结（包括颈上淋巴结群、臂部淋巴结群、椎旁淋巴结群、颈深淋巴结群、纵隔淋巴结群）。放大镜下计数肺表面长径大于2mm的肿瘤数,并用游标卡尺测量每个肿瘤长径,平均肿瘤长径=肿瘤长径之和／肿瘤数。肺肿瘤标本固定、脱水并包埋。切片分别做D2-40和VEGF-C的免疫组化染色。RT-PCR法检测VEGF-C mRNA在小鼠肺腺癌新鲜组织中的表达。按照Trizol的说明书,先用Trizol一步法提取小鼠肺癌组织中的总RNA,然后用紫外分光光度计测定纯度并定量。引物序列：VEGF-C 5’ -AAGACCGTGTGCGAATCGA -3’5’- ACACAGCGGCATACTTCTTCAC -3’β-actin 5’-CACTATTGGCAACGAGCGG-3’5’-TCCATACCCAAGAAGGAAGGC -3’采用贝西生物技术有限公司RT-PCR试剂盒。取总RNA1μg,加入DEPC处理的0.5ml Eppendorf管中,组成20μl逆转录反应体系中,于37℃,1h,95℃10分钟灭活MMLV,终止逆转录。按如下条件组成PCR反应体系,摸板cDNA 2.5μl 5×PCR Buffer 2.5μl灭菌蒸馏水7.2μl聚合酶E×TaqHS 0.1μ上游引物0.1μl下游引物0.1μlTotal 12.5μl混匀快速离心一次反应条件94℃2min 94℃40sec 50-65℃40sec| 35Cycles 72℃1 min 72℃7min 1 Cycle1.5%琼脂糖电泳鉴定。半定量分析：用凝胶成像分析系统测出VEGF-C和β-actin mRNA的表达强度,或计算相对系数。相对系数=特异性基因表达强度/β-actin表达强度。结果1,肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系肺腺癌组织中endostatin阳性染色位于细胞浆和细胞核,以细胞浆表达为主,肿瘤间质细胞也可见阳性染色。Endostatin在60例肺腺癌组织中23例表达为阴性,37例阳性表达,阳性率为61.7%。D2-40阳性脉管呈管腔状、条索状,弥漫或散在分布在癌巢周围间质,常可见癌细胞浸润。Endostatin阳性组MLVD为7.68±1.89,阴性组为9.17±1.95,差异有统计学意义（P<0.01）。单因素方差分析显示,MLVD在不同程度endostatin表达的病例中,随着endostatin表达积分的增高,MLVD减少。Endostatin表达与肿瘤分期有关,Ⅰ-Ⅱ期endostatin阳性表达率显著高于Ⅲ-Ⅳ期（P=0.014）；endostatin阳性组淋巴结转移较阴性组减少（P=0.013）。Endostatin的表达与肿瘤大小、细胞分化程度相关（P<0.05）,与患者性别、年龄和位置无明显相关性。2,重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响对照组及实验组小鼠肺癌发生率均为90%（18/20）,两组分别有两只小鼠未见肺肿瘤发生,不计入统计。对照组小鼠肺表面肿瘤数为5.61±1.24,实验组为4.67±1.14,差异有显著性意义（P=0.023）；对照组肿瘤平均长径为4.033±0.526,实验组为3.461±0.658,差异有显著性意义（P=0.007）。对照组和实验组小鼠分别发现有8例和2例有淋巴结转移,两组差异有统计学意义（P=0.026）。对照组小鼠肺癌组织微淋巴管密度为7.78±1.56,实验组为5.67±1.57；差异有显著性意义（P<0.01）。免疫组化显示对照组小鼠中VEGF-C阳性率为66.7%（12/18）,实验组为27.8%（5/18）,对照组VEGF-C表达阳性率高于实验组（P=0.019）。对照组和实验组肺癌组织中VEGF-C mRNA都有不同程度的表达,对照组癌中高表达（0.644±0.109）,实验组中低表达（0.334±0.104） （P<0.01）。结论1, Endostatin在肺腺癌中的表达与微淋巴管密度和淋巴结转移相关。2, Endostatin表达与肺癌肿瘤大小、细胞分化程度及病理分期相关,与性别、年龄和肿瘤位置无相关性。3,重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌生长、淋巴管生成和淋巴结转移均具有抑制作用。4,重组内皮抑素可下调肺癌VEGF-C基因表达,并进而影响肿瘤生长和淋巴管生成。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 内皮抑素对小鼠体内Lewis肺癌生长及淋巴管生成的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 致谢
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