嗜线虫致病杆菌北京变种抗生素抗性相关基因的研究

论文摘要

嗜线虫致病杆菌北京变种（X．nematophila vat．pekingensis）是本实验室从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫（Steinenema carpocapsae）的共生细菌，经多年研究发现该菌的代谢产物具有杀虫、抑菌、抗癌等生物活性，有着诱人的开发利用前景。本研究对嗜线虫致病杆菌北京变种的质粒转化技术进行了探讨，对菌株的抗生素相关基因片段进行克隆、功能分析和定位，为菌株的遗传改良提供技术支持与理论依据，同时为获得新的功能基因奠定基础。主要研究结果如下： 1) 测定了嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ型菌的抗生素抗性。北京变种对氯霉素、新霉素和卡那霉素敏感；对链霉素、氨苄青霉素和青霉素具有一定的抗性。 2) 首次研究了不同质粒转化方法对北京变种Ⅰ型菌株生理生化特性的影响，确定接合转移是适宜菌株遗传操作的最佳方法。用不同方法制备北京变种Ⅰ型菌的感受态细胞，不同方法对菌株影响各异：经电击操作处理的菌株出现卡那霉素抗性，API试条中V-P反应、蔗糖（SAC）、葡萄糖（GLU）和山梨醇（SOR）利用发生了变化，生长曲线呈双S型，抑菌活性降低；经CaCl2介导的化学转化操作的菌株其卡那霉素抗性、色素吸收、抑菌活性及生理生化特性也受到影响；而接合转移操作处理方法对菌株影响最小，各方面的特性与野生型菌株基本一致。 3) 首次利用接合转移的三亲杂交方法，建立了北京变种Ⅰ型菌株外源质粒转化体系。分别将质粒pSZ21和pLA2917转化到北京变种Ⅰ型细胞中，对菌株的许多代谢途径及性状产生了较大影响。与野生型菌株相比，分别含有外源质粒pSZ21和pLA2917的转移接合子在NBTA培养基上呈暗红色菌落；生长速度明显提高，提前12小时进入指数生长期；一些生理生化反应特别是糖类利用所受影响较大；菌株产素水平也因为质粒的导入而呈大幅度降低的态势。 4) 首次从北京变种中克隆得到抗生素相关基因xbl基因片段。在GenBank提交注册（AccessionNo．：DQ631811）。xbl基因片段的15～731碱基与嗜线虫致病杆菌ATCC19061菌株次级代谢物生物合成功能蛋白对应区域同源性为99％，17～731碱基与发光光杆状菌TTO1菌株抗生素生物合成类似蛋白的编码基因具有85％的序列相似性。 5) 对北京变种具有氨苄青霉素水解活性的xbl-ah基因片段进行原核表达、蛋白纯化及生物活性测定。设计引物从北京变种Ⅰ型细菌中扩增得到xbl-ah序列，构建原核表达载体pET28AH，转化到Ecoli BL21（DE3）细胞中，SDS-PAGE和Western blotting证明该肽段异源表达成功。在不同IPTG浓度、温度以及时间等诱导条件下，发现目的肽段均以包涵体的形式表达。包涵体经溶解、变性、透析复性后表现出氨苄青霉素水解活性。对XBL-AH复性产物用AKTA系统进行亲和层析纯化，并用ELISA进行验证。 6) 对xbl-ah基因片段进行定位，表明xbl-ah基因位于细菌染色体，而非质粒上。本研究从北京变种中首次发现的质粒pBJ-1也表现出氨苄青霉素抗性特征，但推测xbl-ah基因与质粒pBJ-1上的氨苄青霉素抗性基因是两个独立的遗传因子，它们在细胞内发挥着各自的功能。 以上结果将对以后嗜线虫致病杆菌北京变种的遗传操作提供技术支持，并为该菌株抗生素的分子生物学研究奠定基础。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 昆虫病原线虫共生细菌型变研究进展
• 1.1.1 型变
• 1.1.2 型变的可能机理
• 1.1.3 型变的意义
• 1.2 致病杆菌分子生物学研究技术
• 1.2.1 电击转化法
• 1.2.2 化学转化法
• 1.2.3 接合转移法
• 1.3 致病杆菌功能基因研究进展
• 1.3.1 外膜蛋白基因
• 1.3.2 菌毛蛋白基因
• 1.3.3 共生作用相关基因
• 1.3.4 溶血素相关基因
• 1.3.5 杀虫毒素蛋白基因
• 1.3.6 专利保护基因
• 1.3.7 功能未知基因
• 1.4 致病杆菌抗菌代谢产物研究进展
• 1.4.1 致病杆菌抗菌代谢物的抑菌活性
• 1.4.2 致病杆菌的抗菌代谢物质
• 1.5 本研究的立题依据及意义
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究目的和意义
• 第二章 嗜线虫致病杆菌北京变种Ⅰ型菌株质粒转化体系的研究
• 2.1 北京变种的抗生素抗性研究
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 抗生素浓度梯度的配制
• 2.1.2.2 抗生素抗性的测定
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 氯霉素抗性测定
• 2.1.3.2 卡那霉素抗性测定
• 2.1.3.3 链霉素抗性测定
• 2.1.3.4 新霉素抗性测定
• 2.1.3.5 青霉素抗性测定
• 2.1.3.6 氨苄青霉素抗性测定
• 2.1.4 讨论
• 2.2 不同转化方法对北京变种Ⅰ型菌株生理生化特性的影响
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 化学转化用感受态细胞的制备
• 2.2.2.2 化学转化用感受态细胞的空白转化
• 2.2.2.3 电击转化用感受态细胞的制备
• 2.2.2.4 电击转化用感受态细胞的空白转化
• 2.2.2.5 接合转移用感受态细胞的制备
• 2.2.2.6 接合转移用感受态细胞的空白转化
• 2.2.2.7 菌落对色素的吸收
• 2.2.2.8 菌落在API试条的反应
• 2.2.2.9 菌落过氧化氢酶活性测定
• 2.2.2.10 菌落生长曲线的制定
• 2.2.2.11 菌落抑菌活性的测定
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 不同转化方法对北京变种卡那霉素抗性的影响
• 2.2.3.2 不同转化方法对北京变种色素吸收的影响
• 2.2.3.3 不同转化方法对北京变种细胞内代谢作用的影响
• 2.2.3.4 不同转化方法对北京变种过氧化氢酶活性的影响
• 2.2.3.4 不同转化方法对北京变种生长曲线的影响
• 2.2.3.6 不同转化方法对北京变种抑菌活性的影响
• 2.2.4 讨论
• 2.2.4.1 转化操作对北京变种卡那霉素抗性的影响
• 2.2.4.2 不同转化方法对北京变种生理生化特性的影响
• 2.3 外源质粒导入对北京变种生理生化特性的影响
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.2.2 供体质粒和帮助质粒在感受态细胞的电击转化
• 2.3.2.3 质粒在北京变种中的接合转移
• 2.3.2.4 转移接合子的PCR鉴定
• 2.3.2.5 转移接合子中质粒的提取
• 2.3.2.6 转移接合子对色素的吸收
• 2.3.2.7 转移接合子过氧化氢酶活性的测定
• 2.3.2.8 转移接合子在API试条的反应
• 2.3.2.9 转移接合子生长曲线的制定
• 2.3.2.10 转移接合子抑菌活性的测定
• 2.3.2.11 转移接合子氯霉素抗性的测定
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 供体质粒和帮助质粒在大肠杆菌的转化
• 2.3.3.2 质粒在嗜线虫致病杆菌北京变种的接合转移
• 2.3.3.3 转移接合子的PCR鉴定
• 2.3.3.4 转移接合子质粒的稳定性
• 2.3.3.5 转移接合子对色素的吸收
• 2.3.3.6 转移接合子的代谢及生化特征
• 2.3.3.7 转移接合子的生长曲线变化
• 2.3.3.8 转移接合子的抑菌活性
• 2.3.3.9 pSZ21转移接合子的氯霉素抗性
• 2.3.4 讨论
• 2.3.4.1 北京变种遗传转化体系的构建
• 2.3.4.2 外源质粒导入对北京变种Ⅰ型菌株代谢的影响
• 2.3.4.3 pSZ21转化接合子的抑菌活性降低不一定由Tn5转座引起
• 第三章 嗜线虫致病杆菌北京变种抗生素抗性相关基因的研究
• 3.1 抗生素相关基因xbl的克隆与序列分析
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 引物设计和合成
• 3.1.2.2 北京变种Ⅰ型菌株基因片段的PCR扩增
• 3.1.2.3 PCR产物的纯化、连接和转化
• 3.1.2.4 阳性克隆的确定
• 3.1.2.5 序列测定
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 xbl基因片段的PCR扩增
• 3.1.3.2 xbl基因片段的测序
• 3.1.3.3 xbl基因片段的序列分析
• 3.1.3.4 xbl基因序列在Genbank中的注册
• 3.1.4 讨论
• 3.2 氨苄青霉素水解活性肽段XBL-AH的表达与纯化
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 表达载体的构建及诱导表达
• 3.2.2.2 蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.2.3 Western blotting
• 3.2.2.4 包涵体的纯化、变性与复性
• 3.2.2.5 蛋白含量测定
• 3.2.2.6 氨苄青霉素水解活性测定
• 3.2.2.7 诱导表达XBL-AH的蛋白纯化
• 3.2.2.8 ELISA检测
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 xbl-ah基因编码氨基酸的结构预测
• 3.2.3.2 xbl-ah基因的PCR扩增
• 3.2.3.3 携带北京变种xbl-ah基因的质粒pET28AH的构建
• 3.2.3.4 重组表达载体pET28AH的诱导表达
• 3.2.3.5 XBL-AH包涵体的鉴定
• 3.2.3.6 XBL-AH包涵体的变性与复性
• 3.2.3.7 XBL-AH表达产物的氨苄青霉素水解活性
• 3.2.3.8 XBL-AH表达产物的进一步纯化
• 3.2.4 讨论
• 3.2.4.1 XBL-AH表达产物包涵体的形成
• 3.2.4.2 XBL-AH包涵体的复性与纯化
• 3.2.4.3 抗生素相关基因片段xbl-ah的意义
• 3.3 北京变种xbl-ah基因的分布
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.2.1 北京变种Ⅰ型菌株基因组DNA的提取
• 3.3.2.2 北京变种Ⅰ型菌株质粒DNA的提取
• 3.3.2.3 北京变种Ⅰ型菌株质粒在大肠杆菌中的转化
• 3.3.2.4 抗生素抗性测定
• 3.3.2.5 北京变种Ⅰ型菌株基因组和质粒中xbl-ah基因的PCR扩增
• 3.3.3 结果与分析
• 3.3.3.1 北京变种Ⅰ型菌株基因组DNA的提取
• 3.3.3.2 北京变种Ⅰ型菌株质粒DNA的提取
• 3.3.3.3 质粒pBJ-1在大肠杆菌中的转化
• 3.3.3.4 质粒pBJ-1的抗生素抗性测定
• 3.3.3.5 北京变种Ⅰ型菌株xbl-ah基因的定位
• 3.3.4 讨论
• 3.3.4.1 北京变种Ⅰ型菌质粒pBJ-1的发现
• 3.3.4.2 抗生素抗性的起源与进化
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢