高速逆流色谱在天然产物分离制备中的探索性研究（Ⅱ）

论文摘要

目的:（1）建立高速逆流色谱（High-speed counter-current chromato-graphy, HSCCC）与大孔吸附树脂相结合的方法用于天然产物中有效成分的大规模分离纯化;（2）构建反胶团HSCCC分离模式对大鼠肝蛋白和苦瓜蛋白进行分离纯化。方法:（1）HSCCC与大孔吸附树脂相结合用于芫花（Daphne genkwa）中3种黄酮类成分的大规模分离制备。首先比较了9种不同类型树脂对3种化合物的吸附能力和解析率,筛选出合适的树脂对芫花粗提物进行初步纯化,得到粗提物后进行大规模HSCCC分离制备,所得产物纯度经HPLC检测,产物结构经MS和UV鉴定,并与标准对照品对照。（2-1）由药物诱导的大鼠肝脏,经过灌洗、匀浆、差速离心、增溶、PEG沉淀等步骤得到肝脏P450粗提物。再用阴离子型表面活性剂和有机溶剂组成的反胶团溶液为固定相,Tris-HCl缓冲液为流动相,对P450粗蛋白进行分离纯化,产物经SDS-PAGE电泳和UV检测。（2-2）利用碱提取法对苦瓜中的粗蛋白进行提取,再用HSCCC和反胶团溶剂系统对苦瓜蛋白进行分离纯化,所得产物经SDS-PAGE电泳检测,并在胶内酶解后经MALDI-TOF/TOF-MS/MS分析,所得肽段与相关数据库匹配来鉴定结构,体外考察其抗肿瘤活性。结果:（1）通过比较9种树脂对芹菜素、3-羟基芫花素和芫花素这3种黄酮类成分的吸附能力和解析率,优选出D101大孔吸附树脂为分离载体,并确定40%乙醇为除杂溶剂,90%乙醇为洗脱溶剂。在大规模分离中,使用制备型的HSCCC色谱仪,采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（4:5:4:5, v/v/v/v）的溶剂体系从3 g粗提物中经一步分离得到823 mg芹菜素、842 mg3-羟基芫花素和998 mg芫花素,纯度分别为98.79%、97.71%和93.53%。（2-1）采用（0.05 mol/L AOT/异辛烷）反胶团溶液为固定相,Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L Tris, pH=7.0, 0.05 mol/L KCl）为流动相进行HSCCC分离,得到电泳纯已变性失活的P450蛋白。（2-2）采用（0.05 mol/L AOT/异辛烷）反胶团溶液做固定相,以流动相A （0.05 mol/L Tris-HCl, pH=7.0, 0.05 mol/L KCl）和流动相B （0.05 mol/L Tris-HCl, pH=10.0, 0.5 mol/L KCl）进行梯度洗脱从苦瓜粗蛋白中分离出达到电泳纯的三种苦瓜蛋白,体外实验发现其中一种蛋白对人胃癌细胞SGC-7901具有细胞毒作用,作用48小时的IC50为0.116 mg/mL,经NCBInr数据库未检索到相关蛋白,初步鉴定其分子量为36 KD,等电点为8.8,含有343个氨基酸,其结构和功能还需要深入研究。结论:（1）本实验将制备型HSCCC与大孔吸附树脂结合分离芫花中的三种黄酮类化合物,具有制备工艺简单、产物纯度高、绿色环保等优点,适合于工业化生产。（2）利用反胶团HSCCC模式对大鼠肝组织中的P450蛋白和苦瓜蛋白进行了分离纯化,实验结果表明反胶团HSCCC模式能够实现生物大分子的分离纯化,这不仅拓宽了HSCCC的应用范围,也为生物大分子的分离纯化提供了技术支撑。但介于肝药物代谢酶极易变性失活这一特点,如何避免在HSCCC分离过程中蛋白质的变性,将成为HSCCC分离肝药物代谢酶中亟待解决的问题。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二章
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 缩略语
• 发表论文
• 致谢