PKR基因表达载体构建及农杆菌介导玉米茎尖遗传转化

论文摘要

玉米（Zea mays L.）生长期间常受到病毒性病害（矮花叶病、玉米粗缩病等）侵袭和大量杂草与其竞争土壤水分和养料,从而影响到玉米的品质及产量下降。由于在玉米种质资源中至今还未能找到合适的抗原基因,所以常规育种由于抗原的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术把具有对抗病毒病和除草剂抗性的基因整合到玉米的基因组,培育出抗性新品种材料,加速抗病和抗除草剂育种进程。抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR（double-stranded RNA-dependent protein kinase）基因是主要的抗病毒基因。双链RNA依赖的蛋白激酶被细胞内的双链RNA（dsRNA）或病毒复制中间体激活后能使真核生物翻译起始因子-2（eukaryotic Initiation Factor 2,elF-2）的α亚单位（elF-2α）磷酸化,导致病毒蛋白不能启动合成,从而抑制病毒复制,PKR基因在植物抗病毒中能起到有效的作用。此外,编码磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的EPSPS基因具有很高的除草剂草甘膦抗性。因此,构建能同时表达PKR和EPSPS基因的植物表达载体对植物进行转化,将会增强玉米的抗病和抗除草剂草甘膦复合性状。良好受体系统是玉米遗传转化的一个重要环节。选用自交系种子直接培养成的黄化苗的茎尖分生组织为受体进行农杆菌介导的遗传转化,与传统的幼胚及胚性愈伤组织为受体转化体系相比较,具有简便、快速、试验周期短、取材不受季节限制等优点。通过喷洒除草剂进行筛选,提高了工作效率,避免了组织培养过程,为玉米的遗传转化拓宽了受体材料类型,具有很高的应用价值。为了获得抗病毒性病害和抗除草剂草甘膦复合性状转基因玉米种质资源,本试验应用In-Fusion克隆技术开展了PKR-EPSPS双价基因植物表达载体构建和农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化研究,取得了如下结果:1.以pCAMBIA5300为基础载体,用限制性内切酶SacII和AatII将其潮霉素基因（hpt）双酶切切除,然后重组连接EPSPS基因表达框（含有HSP90 intron序列、leading signal to plastids序列、CP4-EPSPS基因）构建以CaMV35S启动子驱动的EPSPS基因的中间载体pCAMBIA5300-EPSPS。用电击法将其导入根癌农杆菌LBA4404。2.将抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因重组连接到经BamHI酶切后的中间载体pCAMBIA5300-EPSPS上,构建了Ubiqutin启动子驱动PKR基因双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS。用电击法将其导入根癌农杆菌LBA4404。3.以感病玉米自交系掖478种子直接培养成的黄化苗的茎尖分生组织为受体,研究了影响农杆菌介导含有EPSPS基因的中间载体转化玉米的各种因素,研究结果表明:合适的菌液浓度（OD600=0.6）中加入乙酰丁香酮（150μmol/L）和表面活性剂（Silweet L-77）（0.04%）在50kPa下真空处理侵染10min,并用1.5‰的除草剂草甘膦浓度对转化植株进行筛选转化效率最高。4.将含有PKR-EPSPS双价基因的pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS植物表达载体的工程农杆菌对玉米自交系掖478茎尖进行农杆菌遗传转化,获得了31株抗性植株,经PCR检测有9株呈阳性,1株结实。5.将含有PKR-EPSPS双价基因的pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS植物表达载体的工程农杆菌转化玉米自交系昌7-2茎尖,获得了27株抗性植株,经PCR检测有14株呈阳性,3株结实。6.将获得的20粒T1代掖478转基因种子种植于温室获得18株T1代转基因植株,待其生长到3～4叶期进行PCR检测,其中有8株呈现阳性,表明其中40%（8/20）的个体是转基因的。7.将T1代转基因植株做分离比（3:1）适合性检验,得出目的基因的分离不符合3:1的分离比,这可能是由于T0代转基因植株为嵌合体所致。但是到T1代植株中的转基因个体已经不再是嵌合体,因此,T0代转基因嵌合体植株对玉米茎尖遗传转化获得的转基因植株的选育没有很大的影响。

论文目录

• 资助项目
• 摘要
• Summary
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 第1章 文献综述
• 1 玉米转基因技术的研究现状
• 1.1 玉米转基因的主要方法
• 1.1.1 农杆菌介导的转化方法
• 1.1.2 基因枪转化方法
• 1.1.3 花粉管通道转化方法
• 1.2 玉米转基因的受体
• 1.3 玉米转基因的载体
• 1.4 In-Fusion 克隆技术在载体构建中的应用
• 2 玉米转基因技术的应用
• 2.1 耐除草剂的转基因玉米
• 2.2 抗病的转基因玉米
• 2.3 耐旱和盐碱的转基因玉米
• 2.4 转基因玉米品质的改良
• 2.5 玉米转基因技术的其它应用
• 3 本研究的目的和意义
• 4 研究技术路线
• 第2章 抗双链RNA 依赖性蛋白激酶PKR 基因表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 工具酶和试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 1.2 方法
• 1.2.1 pCAMBIA5300 基础载体质粒DNA 碱法大提
• 1.2.2 目的基因的扩增
• 1.2.3 目的基因的回收
• 1.2.4 植物表达载体pCAMBIA5300 的改造
• 1.2.4.1 载体pCAMBIA5300 双酶切及纯化
• 1.2.4.2 In-Fusion T-border 序列与线性pCAMBIA5300 载体重组及转化
• 1.2.4.3 重组添加左边界T-border 序列载体质粒pCAMBIA5300 的验证与保存
• 1.2.4.4 重组载体pCAMBIA5300 的AatⅡ单酶切
• 1.2.4.5 In-Fusion EPSPS 基因与线性pCAMBIA5300 载体重组及转化
• 1.2.4.6 重组质粒pCAMBIA5300-CaMV35S-EPSPS 的验证与保存
• 1.2.5 PKR-EPSPS 双价植物表达载体的构建
• 1.2.5.1 中间载体pCAMBIA5300-EPSPS 的BamHI 单酶切
• 1.2.5.2 In-Fusion PKR 基因与线性pCAMBIA5300-EPSPS 载体重组及转化
• 1.2.5.3 重组质粒pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS 的验证与保存
• 1.2.6 中间载体pCAMBIA5300-CaMV35S-EPSPS 电击转化根癌农杆菌及鉴定
• 1.2.7 双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS 转化农杆菌及鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因的扩增结果
• 2.2 载体pCAMBIA5300 的改造
• 2.3 PKR -EPSPS 双价植物表达载体的构建
• 2.4 中间载体pCAMBIA5300-EPSPS 转化根癌农杆菌及鉴定
• 2.5 植物表达载体pCAMBIA5300-PKR-EPSPS 转化农杆菌并鉴定
• 3 讨论
• 第3章 农杆菌介导玉米茎尖遗传转化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 玉米材料
• 1.1.2 试剂与仪器
• 1.1.3 转化的菌株和载体
• 1.1.4 转化的培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 转化的农杆菌保存及培养
• 1.2.2 除草剂筛选浓度的选定
• 1.2.3 农杆菌转化玉米茎尖
• 1.2.4 转化苗的移栽和除草剂筛选
• 1.2.5 农杆菌介导玉米茎尖转化体系的优化
• 1.2.6 转基因玉米植株的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转化玉米植株对草甘膦的抗性及适宜筛选浓度的确定
• 2.2 抗性植株的获得
• 2.3 农杆菌菌液浓度对转化率的影响
• 2.4 农杆菌侵染时间对转化率的影响
• 2.5 乙酰丁香酮（AS）浓度转化率的影响
• 2.6 真空渗透对转化率的影响
• 2.7 表面活性剂（Silweet L-77）浓度对转化率的影响
• 2.8 转基因玉米植株分子检测
• 2.8.1 转基因玉米植株DNA 小量提取
• 2.8.2 掖478、昌7-2T0 代转基因玉米植株PCR 检测
• 2.8.3 掖478T1 代转基因种子的获得及植株PCR 检测
• 2.8.4 昌7-2T1 代转基因种子的获得
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌菌液浓度侵染时间对遗传转化的影响
• 3.2 乙酰丁香酮（AS）对遗传转化的影响
• 3.3 真空渗透和表面活性剂（Silweet L-77）对遗传转化的影响
• 3.4 玉米遗传转化的受体
• 3.5 掖478T0 代转基因植株及其后代的分子检测
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介