论文摘要
目的：探讨组织因子途径抑制物-2（TFPI-2）对肾癌侵袭性及细胞凋亡的影响，TFPI-2在肾癌组织中的表达与基因启动子甲基化关系。茶多酚（EGCG）能够抑制DNA甲基转移酶的活性，导致基因启动子CpG岛去甲基化，激活甲基化沉默基因的表达。本实验检测EGCG对肾癌细胞中TFPI-2基因表达的改变，研究EGCG对肾癌细胞生物学行为的影响。方法：免疫组织化学、蛋白质印迹（Western blot）、荧光定量RT-PCR检测37例肾癌及11例正常肾脏TFPI-2基因表达；TUNEL法检测细胞凋亡；荧光定量甲基化特异性PCR检测TFPI-2基因启动子甲基化。肾癌细胞株786-0分成三组：对照组（药物用PBS代替），10μM EGCG处理组，20μM EGCG处理组。药物处理时间为六天。每组共五个样本。MTT法及流式细胞仪检测EGCG处理组及对照组细胞周期S期比例及细胞凋亡指数。Western b1ot及荧光定量RT-PCR检测EGCG处理组及对照组细胞TFPI-2表达，荧光定量甲基化特异性PCR检测EGCG处理组及对照组细胞TFPI-2基因启动子甲基化程度。肾癌细胞株786-0以浓度为5×106／0．1ml在裸鼠肩胛区皮下注射，建立皮下移植瘤模型，分为三组（每组5只）：对照组（药物用PBS代替），10μM EGCG处理组，20μM EGCG处理组。六周后处死裸鼠。皮下肿瘤、裸鼠肝脏及裸鼠肺脏分别做病理切片，HE染色。了解移植瘤皮下浸润程度及肿瘤向肝、肺转移程度。结果：免疫组织化学检测肾癌与正常肾脏组TFPI-2高表达的比例分别为59．5％，100％，两者间差异有统计学意义，x2=6．50，P＜0．05。肾癌与正常肾脏组TFPI-2蛋白质印迹条带光密度值：0．92±0．36，1．61±0．13，两组差异有统计学意义，t=9．82，p＜0．05。肾癌与正常肾脏组TFPI-2 mRNA相对表达量：0．0019±0．0011，0．0065±0．0008，差异有统计学意义，t=12．51，p＜0．05。肾癌TFPI-2低表达，肾癌分期增加，TFPI-2 mRNA（Spearman等级相关系数：-0．69931，p＜0．05）及蛋白质（Spearman相关系数：-0．93270，p＜0．05）表达下降。肾癌TFPI-2表达1至4级细胞凋亡指数：2．41％、3．90％、6．78％、9．57％，TFPI-2表达不同级别间肾癌细胞凋亡指数差异有统计学意义F=194．97，p＜0．05。TFPI-2表达增加，肾癌细胞凋亡指数上升，Spearman等级相关系数：0．94948，p＜0．05。肾癌TFPI-2基因启动子甲基化阳性组与阴性组TFPI-2 mRNA相对表达量：0．0015±0．0011，0．0024±0．0009，差异有统计学意义，t=-2．57，P＜0．05。肾癌TFPI-2基因启动子甲基化阳性组与阴性组蛋白质印迹条带光密度值：0．82±0．35，1．04±0．34，差异有统计学意义，t=-2．03，p=0．05。基因启动子甲基化阳性组TFPI-2表达低于阴性组。10μM EGCG处理组，20μM EGCG处理组及对照组MTT法检测平均0D值分别为：0．526，0．441，0．577。10μM EGCG处理组及20μM EGCG处理组肾癌786-0细胞株增殖抑制率分别为：8．8％，23．6％。10μM EGCG处理组，20μM EGCG处理组及对照组平均S期比例为：54．31％±4．81％，60．50％±5．01％，71．3％±5．07％。EGCG处理组细胞株细胞周期S期比例低于对照组，差异有统计学意义，F=15．023，P＜0．05。10μM EGCG处理组，20μM EGCG处理组及对照组平均细胞凋亡指数为：1．09％±0．18％，2．27％±0．28％，0．94％±0．30％。EGCG处理组肿瘤细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义，F=40．349，P＜0．05。裸鼠皮下移植肿瘤HE染色，处理组及对照组均未发现局部浸润。裸鼠肝及肺HE染色，处理组及对照组均未发现肿瘤转移病灶。对照组、10μM EGCG处理组及20μM EGCG处理组Westernblot条带光密度值分别为：0．85±0．23，1．47±0．12，1．73±0．15，差异有统计学意义，F=34．391，P＜0．05。对照组、10μM EGCG处理组及20μM EGCG处理组TFPI-2 mRNA相对表达量分别为：0．0035±0．0017，0．0233±0．0042，0．0416±0．0057，差异有统计学意义，F=103．622，P＜0．05。对照组、10μM EGCG处理组及20μM EGCG处理组均未检测到TFPI-2基因启动子甲基化。结论：TFPI-2基因在肾癌组织低表达，TFPI-2基因表达与肾癌侵袭性负相关，促进肾癌细胞凋亡；启动子高甲基化是肾癌TFPI-2基因低表达机制之一。EGCG上调肾癌786-0细胞株TFPI-2基因表达。EGCG诱导的TFPI-2基因表达上调与TFPI-2基因启动子甲基化状态无关，其机制待进一步研究。EGCG抑制肾癌786-0细胞株增殖，诱导肾癌786-0细胞株凋亡。
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标签：肾癌论文; 组织因子途径抑制物论文; 茶多酚论文; 甲基化论文;