壳聚糖/卵透明带DNA避孕疫苗两种粘膜免疫途径的评价

论文摘要

目的:评价卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒经滴鼻和阴道免疫两种途径诱发的粘膜免疫反应、抗生育作用和对卵巢结构的影响,提高卵透明带DNA避孕疫苗的避孕率,并进一步探讨用粘膜免疫避免卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的可行性。方法:制备pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒,分别滴鼻和阴道免疫10只BALB/c小鼠,对照组免疫不含DNA的壳聚糖,第3周和第6周分别加强免疫一次,ELISA法检测小鼠血清、阴道冲洗液中抗pZP3 IgA和IgG抗体;首次免疫后第10周与有生育力的雄鼠合笼交配,统计怀孕雌鼠动物数;首次免疫后第13周解剖动物取出双侧卵巢,制作石蜡切片,作卵巢组织病理学观察。为检测卵透明带DNA避孕疫苗pZP3α抗原在体内的表达,构建重组质粒pEGFP-N1-pZP3α,与壳聚糖制备成纳米微粒,经鼻粘膜和阴道粘膜免疫小鼠,免疫后第2、4、6、8、10天解剖动物,取滴鼻免疫小鼠的气管、肺部组织和阴道免疫小鼠的阴道组织制作冰冻切片,直接在荧光显微镜下观察。结果:在滴鼻和阴道免疫小鼠血清和阴道冲洗液中可以检测到抗pZP3αIgA抗体,抗pZP3 IgA抗体反应强度与持续时间有明显的个体差异;滴鼻免疫组8只小鼠（8/10）未怀孕,阴道免疫组5只小鼠（5/7）未怀孕,对照组全部怀孕,抗生育效果与合笼时血清抗pZP3 IgA反应强度有关;免疫组未怀孕小鼠与免疫组怀孕小鼠及对照组小鼠的卵巢组织均未观察到病理学变化。小鼠免疫pEGFP-N1-pZP3α壳聚糖纳米微粒后制作的冰冻切片在荧光显微镜下观察显示,与对照组小鼠相比,从免疫后第4天开始在免疫组小鼠气管、肺部、阴道的上皮细胞中可以观察到比较微弱的绿色荧光,提示以壳聚糖为释放系统经滴鼻和阴道免疫后在这些部位有pZP3α抗原的表达。结论:pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒滴鼻和阴道免疫小鼠能诱发生殖道粘膜免疫反应,产生较好的避孕效果,并对卵巢组织结构没有影响。粘膜免疫是克服卵透明带抗原免疫引起卵巢功能紊乱的一种值得深入研究的途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1.前言
• 1.1 卵透明带避孕疫苗的研究概况
• 1.2 用DNA疫苗在生殖道诱发粘膜免疫的研究概况
• 1.3 本研究的目的
• 2.实验材料
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 实验材料和试剂
• 3.实验方法
• 3.1 卵透明带DNA疫苗的制备
• 3.1.1 重组质粒pVAX1-pZP3α的制备
• 3.1.2 pVAX1-pZP3α／壳聚糖纳米微粒的制备
• 3.2 卵透明带DNA疫苗的免疫和检测
• 3.2.1 动物免疫和样品收集
• 3.2.2 抗pZP3抗体的测定
• 3.2.3 抗生育实验
• 3.2.4 小鼠卵巢的结构变化观察
• 3.3 以GFP为报告基因检测壳聚糖／DNA疫苗经鼻粘膜和阴道粘膜免疫后的抗原表达
• 3.3.1 融合质粒pEGFP-N1-ZP3α的构建
• 3.3.2 pEGFP-N1-ZP3α在体外的表达鉴定
• 3.3.3 利用报告基因GFP检测ZP3α抗原在小鼠体内的表达
• 4.实验结果
• 4.1 壳聚糖对pVAX1-pZP3αDNA的包裹率
• 4.2 小鼠生理周期不同时期阴道免疫的结果
• 4.3 pVAX1-pZP3α壳聚糖纳米微粒滴鼻和阴道免疫小鼠的动物实验结果
• 4.3.1 小鼠血清抗pZP3 IgA抗体反应结果
• 4.3.2 小鼠血清抗pZP3 IgG抗体反应结果
• 4.3.3 小鼠阴道冲洗液抗pZP3 IgA抗体反应结果
• 4.3.4 抗生育结果
• 4.3.5 小鼠卵巢的组织学观察结果
• 4.4 以GFP为报告基因检测壳聚糖／DNA疫苗经鼻粘膜和阴道粘膜免疫后的抗原表达结果
• 4.4.1 重组质粒pEGFP-N1-pZP3α的构建和鉴定结果
• 4.4.2 重组质粒pEGFP-N1-pZP3α在HeLa细胞中表达的结果
• 4.4.3 利用报告基因GFP检测ZP3α抗原在小鼠体内表达的结果
• 4.4.4 冰冻切片H.E.染色结果
• 4.4.5 冰冻切片间接免疫荧光检测结果
• 5.讨论
• 5.1 本研究的意义
• 5.2 滴鼻、阴道免疫小鼠后诱发的抗ZP3抗体反应
• 5.3 抗生育效果与免疫对小鼠卵巢的影响
• 5.4 重组质粒pEGFP-N1-ZP3α的构建和体外表达
• 5.5 利用报告基因GFP检测DNA在小鼠体内的表达
• 5.6 结论
• 6.参考文献
• 附录
• 在校期间发表的论文
• 致谢