枯草杆菌rib操纵子结构基因在ccpA位点的表达

论文摘要

核黄素是重要的精细化工产品,在医药、食品和饲料工业领域有广泛的应用。目前,核黄素工业生产方法主要是采用重组枯草芽孢杆菌发酵法。在解除了枯草芽孢杆菌嘌呤合成途径的反馈抑制后,核黄素操纵子的表达水平是影响核黄素合成速率和最终产量的关键因素。可以采用构建游离型和整合型的重组质粒,实现核黄素操纵子的过量表达,但是,游离质粒固有的不稳定性,以及整合质粒需要使用抗生素不断选择所带来的环境安全问题,使这种技术方法存在缺陷。CcpA蛋白是枯草芽孢杆菌的一种全局调控蛋白,介导细胞的碳分解代谢物阻遏。CcpA蛋白的缺失可以在一定程度上解除碳分解代谢物阻遏效应,而有利于核黄素的合成。从功能上判断,ccpA基因应该是组成型表达,其启动子应属于中强启动子。利用ccpA基因的表达元件表达核黄素操纵子的结构基因,既可以实现核黄素操纵子的过量表达,又可以缺陷CcpA蛋白,解除碳分解代谢物阻遏对核黄素合成的抑制,是一种构建高产核黄素基因工程菌的简便、多效的方法。本文以产核黄素的重组菌B. subtilis 24为出发菌株,首先采用同源重组方法对其recA基因的缺陷进行了恢复,得到B. subtilis 24 X1。摇瓶培养结果显示,B. subtilis 24 X1的生长速率和最大生物量均高于B. subtilis 24,核黄素合成能力提高了25%。对ccpA基因表达元件进行的序列分析和比对显示,其启动子具有中强启动子的特征,SD序列和终止子序列都与共同序列十分接近,属于强表达元件。采用重叠PCR方法,将ccpA基因的启动子及上游片段、ribDEAH结构基因、ccpA的终止子及下游片段进行拼接,构建出了4.4kb的C1-R-C2片段。然后转化白色的核黄素缺陷株B. subtilis 24CS1,筛选得到了黄色转化子。经PCR扩增和凝胶电泳鉴定显示,ccpA的结构基因被ribDEAH结构基因置换。所得转化子为B. subtilis 24X2。从菌落黄色结果判断,在B. subtilis 24X2中,ribDEAH结构基因被ccpA基因的表达元件正确表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 B.subtilis 的CCR 效应
• 1.1.1 CCR 效应
• 1.1.2 CCR 效应对EMP 途径的影响
• 1.1.3 CCR 效应对TCA 循环的影响
• 1.1.4 CCR 效应对溢流代谢的影响
• 1.1.5 CCR 效应对磷酸戊糖途径的影响
• 1.1.6 CCR 效应对核黄素合成的影响
• 1.2 CCR 效应的调控机制
• 1.2.1 CcpA 蛋白与cre boxes 元件
• 1.2.2 HPr 蛋白与HprK/P 双功能酶
• 1.2.3 CCR 效应的解除对核黄素过量合成的影响
• 1.3 B.subtilis 核黄素操纵子的过量表达与核黄素合成
• 1.3.1 核黄素生物合成途径
• 1.3.2 核黄素操纵子结构及表达调控机制
• 1.3.3 核黄素操纵子过量表达与核黄素过量合成
• 1.3.4 核黄素操纵子过量表达的手段
• 1.3.5 糖代谢和能量代谢途径的改造对核黄素合成的影响
• 1.3.6 B.subtilis 核黄素操纵子过量表达中存在的问题
• 1.3.7 利用ccpA 基因的表达元件表达rib 操纵子的优势
• 1.4 本文的研究目的、内容和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 B. subtilis 出发菌株的筛选
• 2.2.2 B. subtilis 生长曲线的测定
• 2.2.3 B. subtilis 染色体DNA 提取
• 2.2.4 质粒的小规模提取
• 2.2.5 PCR 扩增
• 2.2.6 重叠PCR
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳方法
• 2.2.8 DNA 片段的纯化
• 2.2.9 DNA 片段的切胶回收和纯化
• 2.2.10 DNA 的酶切反应
• 2.2.11 DNA 的连接反应
• 2.2.12 B.subtilis 24 原生质体的制备与转化
• 2.2.13 核黄素摇瓶发酵
• 2.2.14 核黄素浓度的测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 B. subtilis 24 recA 基因的恢复
• 3.1.1 转化子筛选平板的确定
• 3.1.2 recA 基因片段的PCR 扩增
• 3.1.3 B. subtilis 24 recA 基因缺陷的恢复
• 3.1.4 B. subtilis 24 X1 抗生素抗性的鉴定
• 3.1.5 B. subtilis 24X1 的生长特性和产核黄素能力
• 3.2 ccpA 基因表达元件的分析
• 3.2.1 ccpA 基因启动子的分析
• 3.2.2 ccpA 基因的mRNA 前导序列的特征分析
• 3.2.3 ccpA 基因终止子的分析
• 3.3 同源重组片段C1-R-C2 的拼接
• 3.3.1 目标DNA 片段的PCR 扩增
• 3.3.2 重叠延伸PCR 构建C1-R-C2 片段
• 3.4 rib 操纵子结构基因在ccpA 位点的整合
• 3.4.1 C1-R-C2 片段的转化和转化子筛选
• 3.4.2 转化子的PCR 鉴定
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢