毛霉固态培养对松香生物转化的初步研究

论文摘要

松香的主要成分——树脂酸是一类分子式为C19H29COOH的同分异构体的总称。树脂酸及其衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多种生物活性,有广泛的应用前景。随着生物技术的飞速发展,生物转化制备各种药物的研究获得了较大的成功。对松香树脂酸及其衍生物进行生物活性研究是松香资源高值化研究开发的一个重要分支,正在迅速兴起。利用微生物细胞中的酶高效地、选择性地催化松香,以获得具有高活性化学成分的过程,有广阔的应用前景。本实验通过平板划线分离法从松林腐殖质中分离与纯化得到了107株单菌落真菌。从已分离纯化的107株真菌中选70株进行初筛,以松香为底物,利用固态培养发酵对其进行转化,以抑菌实验对发酵产物进行活性追踪。实验结果显示有16株菌株的转化产物粗体物对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌）有不同程度的抑制作用。对初筛得到的16株真菌进行复筛,对发酵产物做抑菌活性实验,最终确定转化产物抑菌效果最好的菌株D8为转化菌株。经过形态鉴定和分子鉴定,确定菌株D8为毛霉菌亚门（Mucoromycotina）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科未定种（Mucorales incertae sedis）、Umbelopsis属。然后又对菌株D8的生物转化条件进行了单因素优化,确定了最佳转化条件为：培养基初始pH值为7.0,培养温度为28.5℃,培养时间12d,底物松香加入量为2mg/mL,接种量为10%,载体棉花球直径为10mm。在最佳转化条件下,通过菌株D8进行大量固态培养转化松香,积累转化产物。经过醇沉法和多级萃取,同时进行活性跟踪,最后对抑菌活性较强的乙酸乙酯萃取相浓缩物进行化合物分离与纯化。通过薄层层析、硅胶柱层析,凝胶柱层析、反相硅胶柱层析和半制备高压液相色谱等色谱方法,从活性菌株D8的固态培养转化产物的乙酸乙酯萃取相浓缩物中分离得到了一个化合物。该化合物对大肠杆菌无抑制作用,对金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用,且抑制效果较好。通过HPLC检测追踪了该化合物的产生过程,发现菌体自身代谢可产生该化合物,而底物松香的加入则加快了该化合物的产生,同时也大大增加了该化合物的生成量,说明松香对该化合物的产生起到了一定的诱导作用。最后通过核磁共振谱分析,确定该化合物为3,4,5-三甲基-1,2-苯二酚。

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摘要

ABSTRACT

插图和附表清单

缩略词

第一章前言

1.1 松香的利用与开发概况

1.1.1 松香简介

1.1.2 松香的利用与开发

1.1.3 松香及其衍生物的生物活性研究

1.2 生物转化技术在药物研究中的应用

1.2.1 生物转化药物化学成分及其特点

1.2.2 生物转化药物化学成分的应用

1.3 研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题

1.3.1 研究内容和研究目标

1.3.2 拟解决的关键问题

1.4 实验采用的技术路线

第二章转化菌株的筛选与发酵工艺条件优化

2.1 实验材料

2.1.1 设备与仪器

2.1.2 培养基

2.1.3 转化菌株与底物

2.1.4 抑菌实验指示菌株

2.2 实验方法

2.2.1 松林腐殖质菌株的分离与纯化

2.2.2 转化菌株的初筛

2.2.3 转化菌株的复筛

2.2.4 抑菌实验阳性对照与阴性对照

2.2.5 发酵工艺条件优化

2.3 实验结果分析与讨论

2.3.1 松林腐殖质菌株的分离与纯化结果

2.3.2 菌株的初筛结果

2.3.3 菌株的复筛结果

8转化产物的阴性对照与阳性对照抑菌实验结果'>2.3.4 菌株D₈转化产物的阴性对照与阳性对照抑菌实验结果

2.3.5 固态发酵工艺条件优化结果

8生物转化产物的大量积累'>2.3.6 菌株D₈生物转化产物的大量积累

2.4 本章小结

第三章活性化合物的分离纯化与鉴定

3.1 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验试剂与材料

3.2 实验方法

3.2.1 菌株形态鉴定

3.2.2 菌株分子鉴定

3.2.3 活性化合物的分离与纯化

3.2.4 HPLC跟踪检测化合物转化过程

3.2.5 化合物结构鉴定

3.2.6 化合物抑菌效力测定

3.3 实验结果

3.3.1 菌株鉴定结果

3.3.2 活性化合物的分离与纯化结果

3.3.3 HPLC跟踪检测化合物转化过程结果

3.3.4 化合物结构解析

3.3.5 化合物抑菌效力测定结果

3.4 本章小结

第四章总结与展望

4.1 全文总结

4.2 创新点

4.3 展望

致谢

参考文献

附录A

附录B

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