论文摘要
胃癌是常见的恶性肿瘤,是消化系发病率最高的肿瘤,约占消化道肿瘤的62%。我国是胃癌高发国家,发病率远高于欧美西方国家。我国每年约有17万人死于胃癌,占消化系统肿瘤死亡人数50%以上。尽管随着医疗水平的提高,综合治疗的运用,胃癌的5年生存率有所提高,但总的来说疗效仍不尽人意。究其原因胃癌早期无典型表现,患者就诊时多为进展期胃癌,手术治疗后多出现转移而导致治疗失败。据报道约40%—60%的患者发生胃癌复发和转移,寻求防治胃癌转移的可靠方法和药物是我们面对的迫切问题。胃癌转移的主要途径为血道转移、淋巴道转移、腹膜种植转移。其中血道转移的危害最大,通过血液循环系统胃癌细胞可在其他脏器形成转移灶,破坏脏器功能最终导致死亡。肝、肺是胃癌血道转移最易发生的器官,文献报道胃癌肝转移的发生率为40-50%,肺转移的发生率为40%左右。肝、肺转移后多以全身化疗为主,尽管结合中药、手术、放疗、免疫治疗,其中位生存时间也仅为6-9月。由此可见,防止转移的发生是治疗胃癌的重要课题,对延长胃癌生存期有重要意义。肿瘤转移的机制及抗肿瘤转移药物的研究是肿瘤研究的热点,肿瘤转移的基本过程已大概清楚,抗肿瘤转移药物集中在抗新生血管、抗血小板聚集、抗血小板活化、抑制转移基因表达、提高免疫等方面,多数处于实验研究阶段,而且这些药物作用途径、作用靶点单一,对于多步骤、多环节、多因素的胃癌转移过程,其抑制转移的作用显得杯水车薪。中药复方是在辩证论治的基础上的合理组合,它含有多种复杂成分,有多种治疗作用。由此,我们从转移的基本过程及相关因素,研究中药复方启膈方的抗转移作用。启膈方是根据《医学心悟》中治疗噎嗝的启膈散化裁而成,临床用于治疗胃癌、食管癌患者。发现启膈方用于晚期胃癌患者可延长生存时间,防止、延缓转移灶的出现;用于胃癌术后患者可防止转移,延长无病生存时间。于是我们考虑该方有抗胃癌转移的作用,本研究从胃癌血道转移的过程入手,探讨启膈方抑制转移的作用环节及作用靶点。本课题从体外实验、体内实验两个方面研究启膈方的抗转移作用。体外培养高侵袭胃癌、食管癌瘤株,启膈方干预后,观察对肿瘤细胞转移能力的影响。体内动物实验,用高肺转移小鼠胃癌瘤株FC接种615小鼠后灌服启膈方,观察肺转移抑制率及对相关转移因子的影响。本课题分为四部分完成:第一部分启膈方对人胃癌细胞MGC、人食管癌细胞EC109黏附的影响目的:观察启膈方对人胃癌细胞株MGC与人胃癌细胞株MGC之间、人食管癌细胞株EC109与人食管癌细胞株EC109之间同质黏附的影响。用不同方法检测比较启膈方组、5FU组、空白对照组的黏附率、聚集体形成率及E-钙黏蛋白表达的差别。方法:复苏人胃癌细胞株MGC、人食管癌细胞株EC109,待细胞呈对数生长期时,随机分为5组。启膈组加入启膈方,使其终浓度为15mg/ml、30mg/ml、60mg/ml,定为启膈方小、中、大剂量组。5FU组加入5FU,使其终浓度为50ug/ml,对照组加入PBS。用机械法检测各组细胞20、40、60分钟黏附情况,计算黏附率。用3-H-Tdr标记的放射性核素法检测各组细胞30、60分钟时液闪仪测定的放射强度,计算黏附率。用机械法检测各组细胞2、4、6、12小时聚集体形成情况,计算聚集体形成率,并测量各组细胞聚集体的最大面积。流式细胞术测定各组E-钙黏连蛋白的相对表达量。结果:机械法检测MGC胃癌细胞,EC109食管癌细胞在20min、40min、60min的黏附率。启膈方各剂量组的黏附率均高于5FU组、空白对照组。启膈方各剂量组与空白对照组、5FU组之间差异有显著性（P<0.01）,空白对照组、5FU组之间差异无显著性（P>0.05）,启膈方各剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。放射核素法检测MGC胃癌细胞、EC109食管癌细胞30分钟、60分钟黏附率,启膈方各剂量组均高于5FU组、空白对照组,启膈方各剂量组与空白对照组、5Fu组之间差异有显著性（P<0.05）,空白对照组、5FU组之间差异无显著性（P>0.05）,启膈方各剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。MGC细胞、EC109细胞启膈方各剂量组的各时间点聚集体形成率、聚集体面积均大于空白对照组、5FU组（P<0.05）,5FU组小于空白对照组（P<0.05）,启膈方各剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。流式细胞仪检测E-钙黏蛋白含量启膈方各剂量组均高于空白对照组、5FU组（P<0.05）,空白对照组与5FU组之间差异无显著性（P>0.05）,启膈方各剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。结论:启膈方可提高MGC人胃癌细胞、EC109人食管癌细胞的黏附率、聚集体形成率、提高了同质黏附能力,5FU对同质黏附率无明显影响,长时间作用于肿瘤细胞后影响聚集体的形成。启膈方可提高MGC人胃癌细胞、EC109人食管癌细胞E-Cadherin蛋白的表达。第二部分启膈方对人胃癌细胞MGC、人食管癌细胞EC109增殖、运动、分泌MMP-2、MMP-9的影响目的:观察启膈方对MGC、EC109细胞增殖能力、运动能力、分泌MMP-2、MMP-9的抑制作用,比较5FU组MGC、EC109细胞增殖抑制率,运动速度、MMP-2、MMP-9活性的不同。方法:MTT法检测肿瘤细胞的增殖。在96孔板上每孔加入细胞悬液100ul,细胞数为2×103,分为启膈方、5FU和空白对照组,启膈方组分别加入启膈方,使其终浓度为15mg/ml、30mg/ml、60mg/ml定为小、中、大剂量组,5FU组加入5FU注射液,使其终浓度为50ug/ml,在空白对照组加入PBS。培养箱中孵育24、48、72h,培养结束前4小时加入MTT,检测各时间点的OD值,计算增殖抑制率。琼脂滴法检测肿瘤细胞运动能力。制作MGC、EC109细胞琼脂悬液,每孔100ul加入24孔板,4℃冷却凝固,测基础半径。分为启膈方小、中、大剂量组、5FU和空白对照组,各组浓度同MTT法。测量各组细胞的运动半径,计算各组细胞的运动速度。明胶酶谱法检测肿瘤细胞分泌MMP-2、MMP-9活性。分组同上,培养24小时后取上清,走聚丙烯酰胺电泳,根据各组条带灰度分析MMP-2、MMP-9活性。结果:启膈方对MGC、EC109细胞体外增殖有明显的抑制作用,并随着药物浓度增加其抑制作用更加明显。启膈方大剂量组对肿瘤抑制作用最强,加药培养MGC细胞24小时,抑制率为60.0%,72小时抑制率最高为77.1%。启膈方各剂量组、5FU组与对照组之间差异均有显著性（P<0.05）。启膈方大剂量组与5FU组差异无显著性（P>0.05）。培养12小时检测各组细胞运动活性均较弱,各组间差异无显著性。培养24小时后,对照组运动能力明显增强,运动速度明显较启膈方各组快,表现出较强的运动活性。5Fu组细胞运动活性较启膈方组增强,差异有显著性（P<0.05）。启膈方各组之间差异无显著性（P>0.05）。空白对照组细胞分泌MMP-2、MMP-9活性明显较启膈方各组、5FU组增强（P<0.05）,其中MMP-2活性增强更明显（P<0.01）,启膈方大剂量组活性均较5FU组减弱,差别有显著性（P<0.05）,中药各剂量组之间差异无显著性（P>0.05）。结论:启膈方可抑制MGC、EC109肿瘤细胞的增殖,启膈方大剂量与5FU对肿瘤细胞增殖MMP-2、MMP-9的抑制作用无差异。启膈方可抑制MGC、EC109肿瘤细胞的运动能力,减慢其运动速度。5FU组细胞运动活性较中药组增强。启膈方可抑制MGC、EC109肿瘤细胞分泌MMP-2,MMP-9的活性。第三部分启膈方对胃癌荷瘤小鼠肺转移的抑制作用目的:观察启膈方对胃癌荷瘤小鼠肿瘤生长的影响,通过计算肺转移结节,观察启膈方对胃癌荷瘤小鼠肺转移的抑制作用。并比较5FU对胃癌荷瘤小鼠肿瘤生长及肺转移的抑制作用。方法:取小鼠胃癌FC细胞悬液分别接种在30只615小鼠右腋皮下,每只0.1ml（1×106个细胞）。接种后随机分为,启膈方、5FU、空白对照三组,每组各10只。接种3天后中药组每天灌服启膈方口服液0.2ml（0.3g）,化疗组每天腹腔注射5FU0.2ml（200ug）,对照组每天灌服生理盐水0.2ml。16天后处死小鼠,剥离肿瘤组织,称瘤重,测肿瘤直径,计算肿瘤体积。取出肺组织用10%中性福尔马林固定,24-48小时后观察,肺组织表面的转移结节,比较各组转移结节数量,计算肺转移抑制率。石蜡包埋切片（厚度4um）,常规HE染色,比较各组肺内转移程度。结果:启膈方组、5FU组瘤重、瘤体积、肿瘤直径明显低于对照组（P<0.01）,启膈方组、5FU组之间差异无显著性（P>0.05）。直接计数肺组织表面白色的转移结节,对照组小鼠100%发生肺转移。启膈方组肺转移结节数少于对照组（P<0.01）其中有4例未见转移结节,转移程度明显较对照组轻（P<0.01）。与5FU组比较,启膈方组肺转移结节数、肺转移抑制率也优于5FU组（P<0.05）,5FU组中有1例未见转移结节,5FU组与对照组的肺转移结节数、肺内转移程度、肺转移抑制率比较差异均有显著性（P<0.05）。结论:启膈方可抑制胃癌荷瘤小鼠肿瘤的生长,减少肺转移的发生,减轻肺转移的程度。5FU也可减少肺转移的发生,减轻肺转移的程度,但转移抑制作用不如启膈方。第四部分启膈方对胃癌转移相关因子的影响目的:观察启膈方对小鼠胃癌移植瘤的黏附分子E-Cad、蛋白水解酶MMP-2、MMP-9、血管内皮生长因子VEGF、微血管密度MVD表达的影响。检测小鼠血浆GMP-140、TXB2水平,比较各组差别。方法:分组、造模、灌药同第三部分实验。摘除眼球取血,获得血浆备用,处死小鼠,剥离肿瘤组织。常规用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋切片（厚度4um）。用SP免疫组化法检测各组肿瘤组织E-Cad、MMP-2、MMP-9、VEGF、CD34的表达,用放射免疫法检测各组小鼠血浆TXB2水平,用酶联免疫法检测小鼠血浆GMP-140水平。结果:各组瘤组织均有E-钙粘蛋白不同程度的表达,启膈方组E-cadherin的表达强于空白对照组、5FU组,差异有显著性（P<0.01）,5FU组E-cadherin的表达强于空白对照组,差异有显著性（P<0.05）。对照组MVD明显高于启膈方组（P<0.01）和5FU组（P<0.05）,启膈方组低于5FU组,差异有显著性（P<0.05）。启膈方组、5FU组的VEGF表达低于对照组,有显著性差异（P<0.05）,5FU组与启膈方组比较无显著性差异（P>0.05）。各组瘤组织均有MMP-2、MMP-9不同程度的表达,启膈方组的MMP-2、MMP-9表达弱于空白对照组,有显著性差异（P<0.05）,5FU组的表达弱于对照组有显著性差异（P<0.01）,与启膈方组比较无显著性差异（P>0.05）。各组小鼠血浆启膈方组、5FU组GMP-140与TXB2含量均明显低于对照组,尤其是血浆GMP-140含量,启膈方组、5FU组与对照组之间有非常显著性差异（P<0.01）,启膈方组、5FU组之间差异无显著性。血浆TXB2水平,启膈方组低于5Fu组,差异有显著性（P<0.05）。结论:启膈方可通过提高黏附分子E-Cad的表达,降低蛋白水解酶MMP-2、MMP-9的表达,降低血管内皮生长因子VEGF表达、降低微血管密度MVD,降低小鼠血浆GMP-140、TXB2水平,而起到抑制转移的作用。
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