华根霉（Rhizopus chinensis）非水相合成活性脂肪酶及其酶学特性的研究

论文摘要

根霉脂肪酶在微生物脂肪酶酶学研究和非水相生物催化中占有重要地位。由于脂肪酶存在广泛的多样性和复杂性,在脂肪酶的基础理论研究和实际应用中仍存在着许多问题,对这些问题的认识和理解仍需要大量的研究积累,以此不断丰富和发展脂肪酶学,并指导和拓展其在工业上的应用。丝状真菌华根霉（Rhizopus chinensis CCTCCM201021）菌体结合脂肪酶具有良好的催化非水相酯化反应的能力和工业应用潜力。本论文主要针对该华根霉非水相合成活性脂肪酶（sRCL）在生产和应用实践中出现的问题,根据其特点和应用目的,采用针对性的表征脂肪酶非水相催化酯合成能力的分析方法,通过对影响该脂肪酶发酵的关键因素研究,在发酵制备一定数量目的脂肪酶的基础上,利用有机溶剂处理等方法修饰提高其非水相合成活性,分离纯化目的蛋白并对其酶学性质和催化特性进行考察,在细胞水平和蛋白质水平进行了较为系统的研究,得到了一些新的发现。（1）影响菌体结合sRCL生产的关键因素研究首先为便于发酵过程控制,降低下游处理难度,以可溶性氮源蛋白胨替代工业应用的固态氮源豆饼粉,结果使菌体结合sRCL发酵水平成倍提高。研究表明豆饼粉等固态可发酵性组分的添加可能使华根霉以类似固态发酵条件下的代谢方式进行生长和代谢及形态分化,从而影响了菌体结合sRCL的产生。各种油脂及其相关物质对该脂肪酶发酵也有较大影响,适当浓度的油酸及其相关物质可直接作为有效的碳源和诱导物。在培养基主要组成中,蛋白胨和天然产物橄榄油是该脂肪酶发酵生产的最佳氮源和碳源底物。研究也发现华根霉液态培养中菌体表观形态对菌体结合sRCL的发酵有重要影响,表面光滑紧密的大菌团虽然菌体生长较慢,却有利于菌体结合sRCL的生产,可作为根据菌体表观形态判断sRCL生产水平的一个表观指征。（2）培养基组成含量及培养条件优化提高菌体结合sRCL的生产为进一步提高sRCL的生产水平,获得一定数量的目的脂肪酶用于后续研究,对发酵培养基各主要成分含量和部分发酵条件进行了考察和优化。在单因素研究的基础上,先后利用正交试验和响应面分析方法对该脂肪酶发酵培养基组成进行了优化。分别以脂肪酶合成活性和脂肪酶产率为指标,得到了优化的培养基组成为:蛋白胨分别为57.94和55.58g/L,橄榄油21.94和22.99g/L,麦芽糖12.91和14.34g/L,K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,起始pH 6.0。在优化条件下,脂肪酶合成活性和脂肪酶产率分别提高了61.5%和93.4%。同时得到了较为准确的脂肪酶生产的相关数学模型。该脂肪酶在摇床水平的最适发酵温度为30℃,200 r/min的摇床转速不仅可以得到较高的脂肪酶合成活性,并且使脂肪酶最佳发酵时间缩短约12小时。由于通常使用的发酵罐、特别是机械搅拌发酵罐培养方式限制了特定表观菌体形态的形成,该脂肪酶的发酵罐生产水平较低。（3）sRCL在华根霉细胞上的定位及其有机溶剂处理的影响为了对菌体结合sRCL进行深入研究,首先对其在菌体细胞上的位置进行了确定。利用真菌破壁酶Yatalase处理和去污剂提取分析,该脂肪酶被定位为膜结合蛋白。Yatalase处理可破坏菌体细胞壁结构,增加底物与酶的接触,从而提高该膜结合sRCL的活性。发酵得到的sRCL利用一些有机溶剂处理合成活性也得到了改善,其中异辛烷处理使脂肪酶合成活性增强最为显著。丙酮处理也可显著提高单位质量脂肪酶活性,但回收率降低,可用于该脂肪酶的“浓缩”或“纯化”。通过电镜观察,异辛烷等适当的有机溶剂处理与Yatalase处理作用相似,可使菌体表面结构发生改变,使膜结合sRCL更多地暴露,从而提高该膜结合sRCL的合成活性。对有机溶剂处理条件的研究表明,异辛烷4℃下处理1小时增强膜结合sRCL合成活性的效果最好,脂肪酶合成活性可提高56%,而活性回收率也提高26%。将其应用于催化庚烷中己酸乙酯的合成,催化效果确实得到了提高。利用这种处理方法,异辛烷和丙酮都可以制备用于非水相催化的“干”的脂肪酶制剂,而异辛烷处理更有利于提高该膜结合sRCL非水相中的合成活性。（4）膜结合sRCL的分离纯化及其分子特性研究进一步对该膜结合sRCL进行分离纯化,以便深入至蛋白质水平进行研究。采用常用的去污剂洗脱对膜结合蛋白进行分离提取,以含1.5%去污剂Triton X-100的缓冲液洗脱4小时,可以得到较好的提取效果,但进一步的纯化却相当困难。考察该脂肪酶粗酶提取液的性质发现,该膜结合sRCL对温度和pH都较为敏感,稳定性较差。而且该脂肪酶具有很强的疏水性,Triton X-100对维持其溶解性有重要作用,利用Bio-Beads SM-2树脂吸附去除Triton X-100易引起脂肪酶的聚集沉淀。普通的纯化方法对该膜结合脂肪酶的纯化有较大困难。根据有机溶剂处理的研究结果,丙酮处理可以“纯化”该膜结合sRCL,并使菌体结构破坏。利用缓冲液对其进行充分洗涤,能够去除大量杂蛋白,再经Triton X-100溶液提取,有可能提高该膜结合蛋白的纯化效率。采用上述纯化策略,确实得到了相当纯的目的蛋白,纯化倍数提高接近17倍。进一步通过超滤浓缩和阴离子交换层析,使目的蛋白sRCL得到了纯化。利用此纯化方法,可以简便而快速地纯化得到膜结合sRCL。纯化的膜结合sRCL分子量约为32 kDa,其蛋白N-末端氨基酸序列为SDSCEVVQ,Blast分析未发现与其同源性较高的已报道脂肪酶。该蛋白等电点约在4.5左右,为一个酸性蛋白。Triton X-100的存在对该脂肪酶分子大小、电荷性等表观分子特性有较大影响。（5）纯化的sRCL酶学性质和催化特性研究分别以脂肪酶合成活性和水解活性为表征,对纯化的膜结合sRCL酶学性质进行考察。结果表明:温度、pH、各种化合物等环境因素对该脂肪酶合成活性和水解活性的影响差异较大。sRCL合成活性主要受阴离子的影响,而金属离子则明显影响其水解活性。其中,Cl-强烈抑制该脂肪酶合成活性,而磷酸根离子则对该活性有一定的提升。Zn2+显著提高了该脂肪酶的水解活性,但Fe2+和Fe3+,特别是Hg2+,却强烈抑制这一活性。研究表明该脂肪酶不是金属酶,二硫键在维持其活性构象中的作用也不大,该脂肪酶合成活性中心可能含有Ser。该脂肪酶催化有机相酯化反应,以乙醇为酰基受体时辛酸是最适的底物,对碳链长度大于8的中长链脂肪酸也有较高的催化酯合成的能力。以辛酸为酰基供体,脂肪醇底物特异性最好的是正丁醇;除了甲醇,该脂肪酶对碳链长度小于10的脂肪醇都有较高的合成活性。该脂肪酶的水解活性对月桂酸酯(C12)的脂肪酸链长特异性最高,对中长链的脂肪酸酯也具有较高的水解活性。该脂肪酶不表现出对三甘酯的位置选择性。这些性质表明,膜结合sRCL是一种通常意义上的真正脂肪酶,但与一般的根霉脂肪酶有较大差异,结合其分子特性可以认为是一种新型脂肪酶。对纯化的sRCL有机相催化特性进行研究,结果表明,该脂肪酶对丙酮和非极性烷烃类有机溶剂（3.5＜Log P＜5.1）有较好的耐受性。与菌体结合脂肪酶相比有机溶剂处理基本没有增强纯化的sRCL合成活性,这一结果进一步证实,有机溶剂处理对菌体结合脂肪酶活性的影响主要是由于菌体结构的改变。同样,sRCL在非极性溶剂（Log P＞3.5）介质中的合成活性也相对较高,其中庚烷是该脂肪酶的最适反应介质。此外,有机相反应体系中初始水活度对该脂肪酶催化活性影响不大。以上结果表明,该膜结合sRCL比较适合非水相催化酯合成反应的应用。对近来发现的去污剂Triton X-100和三甘酯及其水解产物等对脂肪酶活性的调节进行了探讨。结果表明,上述活性调节因子对该脂肪酶活性的调节机制可能相当复杂,现有的脂肪酶催化机制尚需完善。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 脂肪酶概述
• 1.2 微生物脂肪酶的研究进展
• 1.2.1 微生物脂肪酶的认识和研究
• 1.2.2 根霉脂肪酶的研究
• 1.3 本论文的立题意义和主要研究内容
• 1.3.1 本论文的研究目的和立题意义
• 1.3.2 本论文的研究思路与主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 影响菌体结合的华根霉合成活性脂肪酶生产的关键因素研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 研究方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 调整氮源和培养基状态对华根霉菌体结合脂肪酶发酵的影响
• 2.3.2 油脂及其相关物质对华根霉菌体结合脂肪酶发酵的影响
• 2.3.3 华根霉表观菌体形态对菌体结合脂肪酶合成活性的影响
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 培养基组成含量对菌体结合华根霉合成活性脂肪酶的影响及培养条件优化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 研究方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 培养基组成含量对菌体结合华根霉合成活性脂肪酶发酵的影响
• 3.3.2 菌体结合华根霉合成活性脂肪酶培养基组成优化
• 3.3.3 培养条件对菌体结合华根霉合成活性脂肪酶发酵的影响
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 华根霉合成活性脂肪酶的定位及其有机溶剂处理的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.2.5 研究方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 菌体结合华根霉合成活性脂肪酶的定位
• 4.3.2 有机溶剂处理对华根霉膜结合脂肪酶活性的影响及其作用机制
• 4.3.3 有机溶剂处理条件对华根霉膜结合脂肪酶合成活性的影响
• 4.3.4 有机溶剂处理的华根霉合成活性脂肪酶催化有机相己酸乙酯的合成
• 4.4 小结
• 参考文献
• 第五章 膜结合的华根霉合成活性脂肪酶的分离纯化及其分子特性
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要试剂
• 5.2.4 主要仪器
• 5.2.5 研究方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 华根霉合成活性膜结合脂肪酶的提取
• 5.3.2 华根霉膜结合脂肪酶粗酶提取液的性质
• 5.3.3 丙酮处理菌体的洗涤改善华根霉合成活性膜结合脂肪酶的分离纯化
• 5.3.4 华根霉合成活性膜结合脂肪酶的纯化
• 5.3.5 华根霉合成活性膜结合脂肪酶的蛋白分子特性
• 5.4 小结
• 参考文献
• 第六章 华根霉合成活性膜结合脂肪酶的酶学性质及催化特性
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌种
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 主要试剂
• 6.2.4 主要仪器
• 6.2.5 研究方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 纯化的华根霉合成活性膜结合脂肪酶的酶学性质
• 6.3.2 有机溶剂对纯化的华根霉合成活性膜结合脂肪酶催化活性的影响
• 6.3.3 添加物对纯化的华根霉合成活性膜结合脂肪酶活性的影响
• 6.4 小结
• 参考文献
• 主要结论及研究展望
• 论文主要创新点
• 致谢
• 附录:作者在学期间已发表的论文和取得的学术成果