增殖性玻璃体视网膜病变患者玻璃体蛋白质组研究

论文摘要

目的:（1）建立和优化玻璃体（vitreous humor, VH）双向凝胶电泳-质谱技术。（2）利用双向凝胶电泳（2-DE）技术对增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy, PVR）眼与健康捐献眼（对照组）的VH蛋白质表达谱进行比较,寻找PVR的VH差异蛋白质。（3）结合肽质量指纹谱技术（PMFs）对差异蛋白点进行鉴定和数据搜索。阐明差异蛋白与PVR的关系,寻找PVR的疾病特异性蛋白（DSPs）,为PVR的诊断和药物治疗提供新的方法。方法:（1）通过玻璃体切割手术收集未经稀释的PVR患者VH为实验组,健康捐献眼VH为对照组。（2）提取实验组和对照组VH总蛋白。（3）分别以冷丙酮沉淀、TCA/丙酮沉淀法提纯浓缩VH蛋白质,以固相pH梯度-等电聚焦（IPG-IEF）为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向凝胶电泳（2-DE）对VH蛋白进行二维分离,并对标本处理、2-DE方法进行优化。（4）采集凝胶图像,以PDQuest软件进行图像分析,寻找有意义的差异蛋白点。（5）将差异蛋白质点取出、酶解,进行质谱（MS）鉴定,得到肽质量指纹谱（PMF）,采用Mascot和MS-fit软件进行国际互联网数据检索,找到差异蛋白。结果:（1）对比两种样品提纯浓缩方法,发现对初步提取出的VH蛋白质进行冷丙酮沉淀可得到满意的电泳样品浓度和纯度。（2）比较不同pH范围的电泳分离效果,发现VH蛋白集中在pH4-7范围,使用pH7-4的IPG胶条进行一向分离效果更好。（3）比较不同上样量获得的2-DE图谱,认为上样量300μg对最后进行银染的17cmIPG胶条最合适,得到分辨率较高的2-DE图谱。（4）经过优化电泳条件获得了重复性较好的2-DE图谱,对实验组和对照组2-DE图谱进行分析得到12个差异蛋白点。实验组高表达9个,低表达3个。（5）对差异蛋白进行质谱鉴定,鉴定出4个可能与PVR相关的差异蛋白质,分别为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（Guanine nucleotide-binding protein G,G protein）、分拣连接蛋白11（Sorting nexin 11, SNX11）、类光传感因子蛋白（Phosducin-like protein, PHLP）、S100-A7蛋白。其中G蛋白及S100A7在实验组表达上调,SNX11及PHLP在实验组表达下调。结论:（1）本研究确立了稳定的临床玻璃体标本采集方法,成功建立和优化了VH蛋白质的2-DE/MS技术。（2）实验组与对照组VH的蛋白质表达有明显差异,4种蛋白质在PVR玻璃体中高表达或低表达,分别为G蛋白、S100A7蛋白、分拣连接蛋白11、类光传感因子蛋白。（3）得到的4种蛋白质在功能上均与细胞增殖分化密切相关,推测可能在PVR形成过程中对多种PVR细胞尤其是RPE细胞的异常增殖和分化起一定作用。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章