杆状病毒新型表达系统及P74基因功能和杀虫剂800亩田间释放研究

论文题目: 杆状病毒新型表达系统及P74基因功能和杀虫剂800亩田间释放研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 周文科

导师: 齐义鹏

关键词: 杆状病毒,宿主范围,表面展示,重组病毒,杀虫剂,安全评价

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 从大肠杆菌菌株DH10Bac中提取Bacmid,与质粒pGEM-egfp△Ac74 DNA共转染Sf-9细胞,二者在Sf-9细胞内利用Ac-p74基因的侧翼序列进行同源重组,得到重组穿梭载体Bacmid-egfp。收集有绿色荧光的Sf-9细胞上清,进行五轮空斑纯化,并经PCR检测后,得到纯化的重组Bacmid-egfp,从第5轮空斑纯化的Sf-9细胞提取总DNA,电转化E.coli DH10B感受态细胞,在含Kan~r/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取兰色单菌落,即得到含重组Bacmid-egfp的菌株;再将从E.coli DH10Bac中提取的助手质粒pMon7124转化其中,在含Kan~r/Tet~r/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取兰色单菌落,得到了E.coli DH10Bac-egfp菌株,其Bacmid经改造后带有EGFP标记。从E.coli DH10Bac-egfp提取Bacmid-egfp DNA,转染Sf-9细胞后5天,在荧光显微镜下可以观察到大部分细胞都发出绿色荧光,表明从E.coli来源的Bacmid-egfp DNA仍然保持着对Sf-9细胞的感染性;利用该菌株转座构建的重组穿梭载体Bac-egfp-polh DNA转染Sf-9细胞后,所有产生绿色荧光的细胞都有病毒包涵体的形成,而且所有形成包涵体的细胞都有绿色荧光;我室刘鑫博士利用Bacmid-egfp穿梭载体成功地表达了麻疹病毒受体SLAM,以绿色荧光作标记发现表达的SLAM蛋白定位在Sf-9细胞表面,与人类细胞中的自然定位相同。而且Sf-9细胞表面的SLAM可以介导麻疹病毒对非受纳昆虫细胞的感染。证明该系统维持了亲本Bac to Bac系统的特性和功能,但却增加了亲本Bacmid所不具有的绿色荧光筛选标记。将多角体蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的融合表达盒经Bac to Bac系统转

论文目录:

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第一部分文献综述

第一章杆状病毒的分子生物学

1.杆状病毒的分子结构

2.杆状病毒对宿主的侵染

2.1 侵染历程

2.2 病毒粒子侵入宿主细胞

3.杆状病毒DNA的复制

3.1 杆状病毒DNA的复制起始点(ori)

3.2 杆状病毒DNA的复制方式

3.3 杆状病毒DNA的复制起始

3.4 杆状病毒DNA复制的有关基因及功能

4.杆状病毒基因的表达与调控

4.1 杆状病毒基因表达的时序性

4.2 杆状病毒基因表达的顺／反式调控

5.杆状病毒宿主特异性

5.1 限制宿主域的一般因素

5.2 宿主域有关的病毒基因

第二章杆状病毒的表达系统

1.杆状病毒表达载体系统的特征

1.1 杆状病毒表达载体系统的优势

1.2 杆状病毒表达载体系统的不足

2 杆状病毒表达系统的策略

3.杆状病毒表面展示系统

4.杆状病毒表达系统的进一步发展

第三章杆状病毒杀虫剂研究进展

1.杆状病毒杀虫剂和重组杆状病毒杀虫剂

2.重组杆状病毒杀虫剂安全性

3.重组杆状病毒杀虫剂构建策略

3.1 插入外源基因

3.2 缺肝状病毒基因

3.3 宿主域改造

本研究的背景、目的和意义

第二部分研究工作

第一章研究方法与技术

1.分子生物学实验技术

1.1 质粒DNA的制备和纯化

1.2 限制性酶消化

1.3 DNA片段回收

1.4 DNA片段和载体的连接

1.5 感受态细胞的制备

1.6 质粒DNA的转化

1.7 菌种的保存

1.8 PCR

1.9 SDS-PAGE

1.10 Western blot

2.昆虫细胞培养实验技术

2.1 细胞培养基的配制

2.2 细胞传代培养

2.3 细胞的冻存与复苏

2.4 细胞转染

3.杆状病毒学实验技术

3.1 杆状病毒在昆虫中的增殖、分离和提纯

3.2 杆状病毒在细胞中的增殖、纯化和空斑滴定

3.3 Bac to Bac实验技术

第二章杆状病毒新型Bac to Bac系统的构建

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 质粒、菌株、酶、试剂

2.2.2 血清、培养基、细胞和病毒

2.2.3 PCR引物

2.3 实验方法

2.3.1 质粒的提取分离

2.3.2 共转染与同源重组

2.3.3 空斑纯化

2.3.4 转化E.coli DHIOB感受态细胞

2.3.5 转座与转染

2.3.6 绿色荧光蛋白(EGFP)表达及包涵体形成的检测

2.3.7 免疫细胞化学分析

2.3.8 免疫荧光激光共聚焦

2.4 研究结果

2.4.1 转座助手质粒pMon7124的分离鉴定

2.4.2 新型Bacmid-egfp的鉴定

2.4.3 E.coli DHIOBac-egfp菌株的鉴定

2.4.4 Bacmid-egfp对Sf-9细胞感染性的检测

2.4.5 新型Bacmid-egfp的进一步改进

2.4.6 新型Bac to Bac系统的应用

2.5 讨论

第三章杆状病毒包涵体表面展示系统的研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.2.1 质粒、菌株、酶、试剂

3.2.2 血清、培养基、细胞

3.2.3 PCR引物

3.3 实验方法

3.3.1 重组质粒的构建

3.3.2 转染与病毒包装

3.3.3 SDS-PAGE

3.3.4 组织切片及电镜检测

3.4 研究结果

3.4.1 重组病毒vAc-pol／gfp的鉴定

3.4.2 EGFP在重组病毒包涵体表面的展示

3.5 讨论

第四章囊膜蛋白P74是杆状病毒感染宿主的特异性因子

4.1 引言

4.2 实验材料

4.2.1 质粒、菌株、酶、试剂

4.2.2 细胞与病毒

4.2.3 PCR引物

4.3 实验方法

4.3.1 重组病毒的构建

4.3.2 病毒包装

4.3.3 ODV的提取纯化及ODV囊膜蛋白的提取分离

4.3.4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

4.3.5 SDS-PAGE与WesternBlot

4.3.6 生物测定

4.4 研究结果

4.4.1 重组病毒的构建及包装

4.4.2 重组病毒中p74基因的表达检测

4.4.3 重组病毒中p74基因的转录检测

4.4.4 P74蛋白在重组病毒ODV囊膜上的异源装配

4.4.5 p74基因的宿主特异性

4.5 讨论

第五章重组杆状病毒杀虫剂的环境释放试验研究

5.1 引言

5.2 实验材料

5.2.1 供试病毒杀虫剂

5.2.2 溶液、试剂及PCR引物

5.3 实验方法

5.3.1 田间试验地点：

5.3.2 重组病毒杀虫剂对昆虫群落影响的调查方法

5.3.3 重组病毒对转田间昆虫群落影响的统汁方法

5.3.4 重组病毒杀虫剂对田间害虫防治效果的调查统计方法

5.3.5 重组病毒杀虫剂的后效性生物测定方法

5.3.6 重组病毒杀虫剂在环境中适应性的检测方法

5.3.7 田间样本的PCR检测方法

5.3.8 重组病毒杀虫剂对蔬菜品质影响的检测

5.4 研究结果

5.4.1 重组病毒杀虫剂对田间害虫防治效果

5.4.2 重组病毒杀虫剂对田间害虫天敌种群的影响

5.4.3 重组病毒杀虫剂对田间昆虫群落影响

5.4.4 重组病毒杀虫剂在田间的残效

5.4.5 重组病毒杀虫剂在环境中的适应性

5.4.6 重组病毒杀虫剂对蔬菜产量的影响

5.4.7 重组病毒杀虫剂对蔬菜品质的影响

5.5 讨论

研究总结

创新点

参考文献

博士期间已发表和待发表论文

致谢

农业部食品质量监督检验测试中心检验结果报告书

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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